EGFR19/21基因突變與NSCLC組織中 p53蛋白表達的關系及對預后的影響

陳焱，宋小平

1北京新里程腫瘤醫院外科，北京100081

2清華大學第一附屬醫院胸外科，北京100081

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的發病率維持在443/10萬～567/10萬，在合并吸煙或者其他高危因素的人群中，其發病率可進一步升高[1-2]。NSCLC患者的5年生存率或者中位生存時間等指標均較低[2]，治療后，其無進展生存期或者無瘤生存期等指標依然不太理想。個體化治療在NSCLC的治療過程中占據了重要的地位，在延長NSCLC患者生存時間、緩解NSCLC患者病情方面發揮重要的作用。基因突變能夠影響NSCLC治療的敏感性，導致個體化臨床治療結局出現差異。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的基因突變，能夠影響EGRF下游信號通路的激活程度，抑制不同腫瘤信號蛋白的上調，抑制腫瘤細胞的增殖、分化等病理過程[3-4]。為了進一步揭示EGFR19/21基因突變與NSCLC的關系，本研究收集了98例NSCLC患者的NSCLC組織標本，旨在探討EGFR19/21基因突變與NSCLC組織中p53蛋白表達的關系及其對患者預后的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年1月至2013年7月北京新里程腫瘤醫院和清華大學第一附屬醫院的98例NSCLC患者的NSCLC組織標本。納入標準：①NSCLC患者的診斷標準依據《中國原發性肺癌診療規范（2015年版）》的標準[1]；②采用2010年美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）最新分期（第7版）中的標準；③患者年齡＜80歲；④所有患者均經病理學檢查確診為NSCLC；④未合并其他系統嚴重疾病者。排除標準：①患者于采集標本前已經實施過放、化療；②患者合并其他部位的惡性腫瘤；③患者的各項臨床、病理學資料缺失。98例NSCLC患者中，男67例，女31例；年齡41～79歲，平均（58.0±10.0）歲；腫瘤直徑：＞3 cm者41例，≤3 cm者57例；TNM分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期40例，Ⅲ期28例，Ⅳ期5例；發生淋巴結轉移者46例，未發生淋巴結轉移者52例；分化程度：高分化25例，中分化30例，低分化43例；EGFR19/21基因檢測結果：EGFR19/21突變患者44例，EGFR19/21野生型患者54例。

1.2 檢測方法

免疫組織化學法檢測p53蛋白的表達情況：石蠟切片脫蠟至水，采用離子水進行反復洗滌，加入牛奶液體封閉抗體，封閉時間為5 min，加入p53蛋白抗體（鼠來源，購自Abcam公司），37℃孵育2 h，采用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，滴加熒光染色標記的二抗抗體（購自Abcam公司），37℃孵育30 min，加入磷酸鹽緩沖液進行洗滌，采用南京凱基生物制劑公司生產的顯色劑進行顯色，封片，鏡下觀察。采用Taqman-ARMS法檢測腫瘤組織中EGFR19/21基因的突變情況。

Taqman-ARMS法檢測基因突變：取凍存的血清保存液體，按照10 000 r/min的離心速度進行離心分離，離心時間為5 min，每1 ml的TRⅠZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，進行裂解操作，4℃冰上采用無酶的RNA沖洗液進行洗滌，再次10 000 r/min離心5 min，得到RNA。混合液在加入逆轉錄酶MMLV之前先70℃干浴3 min，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5 μl，37 ℃水浴60 min，室溫放置5 min使其完全溶解，使其逆轉錄為cDNA。以β-actin為模版，在反應體系中加入SYBR Green 1染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得總體積達 20 μl，上機，反應條件：93℃ 2 min，93℃ 1 min，55℃ 2 min，共40個循環。PCR產物擴增后進行基因多態性檢測：參考MultiplexKit試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）使用說明書，加入各位點對應延伸引物進行單堿基測序反應。采用ABⅠ1310（購自美國Life Technologies公司）完成電泳，結果用Gene-Mapper軟件（購自美國Life Technologies公司）進行分析。

1.3 評價指標

觀察NSCLC患者p53蛋白的陽性表達情況，比較不同臨床特征NSCLC患者EGFR19/21基因突變發生率的差異，比較EGRF突變組患者與野生型組患者生存情況的差異，分析NSCLC患者預后的影響因素。免疫組化結果判定：p53蛋白主要表達于細胞核，呈現黃色、棕黃色、褐色顆粒即為陽性表達。根據染色強度評分：若細胞無染色，則計0分；若細胞染色為淡黃色，則計1分；若細胞染色為棕黃色，則計2分；若細胞染色為褐色、黑色，則計3分。根據陽性細胞所占比例評分：陽性細胞數目占總細胞的10%及以下，則計1分；陽性細胞數目占總細胞的11%～50%，則計2分；陽性細胞數目占總細胞的51%～75%，則計3分；陽性細胞數目占總細胞的76%及以上，則計4分。每例患者的總分=染色強度評分×陽性細胞所占比例評分；分值范圍為0～12分；總分＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件對-數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示；計數資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存時間的比較采用Log-rank檢驗；多因素分析采用Cox比例風險回歸分析法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR19/21基因突變與NSCLC患者 p53蛋白表達的關系

EGFR19/21基因突變組NSCLC患者p53蛋白的陽性表達率為38.64%，低于野生型組NSCLC患者的59.26%，差異有統計學意義（χ2=4.125，P＜0.05）。（表1）

表1 EGFR19/21基因突變NSCLC患者 p53蛋白表達情況[ n（%）]

2.2 EGFR19/21基因突變與NSCLC患者臨床特征的關系

不同年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況、病理類型、ECOG評分NSCLC患者EGFR19/21突變的發生率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 EGFR19/21基因突變與NSCLC患者臨床特征的關系

2.3 EGFR19/21基因突變與NSCLC患者生存率的關系

EGFR19/21突變組患者的3年累積生存率為55.80%，高于野生型組的 33.50%（χ2=4.339，P＜0.05）。突變組和野生型組各有2例患者失訪，突變組患者的生存時間為34.0個月（95%CⅠ：26.5～38.9），長于野生型組的 27.0個月（95%CⅠ：20.86～33.14）[Log Rank（Mantel-Cox）=5.9335，P＜0.05]。（圖1）

圖1 兩組患者的生存曲線

2.4 NSCLC患者預后影響因素的多因素分析

以NSCLC患者的3年累積生存率作為因變量，以NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結轉移情況、分化程度、病理類型、ECOG評分及p53蛋白表達作為自變量進行Cox回歸分析，結果顯示：TNM分期高、有淋巴結轉移、分化程度為低分化、p53蛋白陽性表達是影響NSCLC患者預后的獨立危險因素（P＜0.05），EGFR19/21基因突變是影響NSCLC患者預后的保護因素（P＜0.05）。（表3）

3 討論

NSCLC的病情進展可以導致患者的生存預后的惡化，流行病學研究顯示，NSCLC的臨床總體治療效果仍然較差，臨床總體治療敏感性不足35%[5-6]。揭示NSCLC患者治療敏感性差異的原因，能夠為后續臨床上NSCLC的治療、預后評估或者隨訪等提供參考依據。基因水平的改變可能是影響NSCLC臨床治療結局的重要因素，基因的改變能夠通過對效應蛋白表達的影響干預腫瘤細胞的生物學特征[6]。EGFR19/21是重要的血管內皮生長因子受體家族成員，其對于配體的結合作用能夠影響AKT或者Notch信號通路的激活，促進下游腫瘤細胞對于鄰近正常組織的浸潤，增加腫瘤細胞通過淋巴結或者血管內皮細胞進行轉移的風險[7-8]。EGFR19/21基因突變的發生能夠影響EGFR19/21對于配體結合的生物學效應，導致EGFR蛋白的空間結構的改變，影響其蛋白的生理功能[9]。部分研究認為，EGFR19/21基因突變導致的蛋白水平的變化，在抑制下游信號通路蛋白的激活方面均具有一定的作用[10]，p53信號通路是重要的腫瘤細胞信號通路，其表達水平的改變能夠在細胞周期的調控、細胞生物學特征的維持或者腫瘤細胞凋亡、調控過程中發揮作用，降低腫瘤細胞的程序性凋亡水平，促進腫瘤細胞的增殖，提高腫瘤細胞分化障礙的發生率。

表3 影響NSCLC患者預后的多因素分析

本研究發現，EGFR19/21基因突變組患者p53蛋白的陽性表達率為38.64%，低于野生型組的59.26%，差異有統計學意義（P＜0.05），提示基因突變組患者體內的腫瘤相關信號通路蛋白的表達濃度較低，p53蛋白的異常表達能夠在下列幾個方面影響腫瘤的發生：①EGFR19/21基因突變組患者體內突變的EGFR，能夠導致配體結合障礙，促進血管內皮細胞的形成，導致腫瘤細胞血流灌注發生障礙，腫瘤細胞增殖相關信號通路p53蛋白的合成明顯減少；②突變的EGFR能夠導致患者p53基因轉錄調控啟動子或者增強子的相對沉默，導致p53蛋白的翻譯減少[11-12]。王灃等[13]、馬玲等[14]通過探討73例肺癌患者的基因突變水平發現，EGFR的突變程度對于體內不同信號通路蛋白，特別是p53或者P16等蛋白的表達具有重要的影響，EGFR的突變風險越高，抑癌基因蛋白的表達濃度越低。但本研究并未發現不同的臨床特征對于EGFR19/21基因突變的影響，細胞分化程度、臨床分期或者淋巴結轉移等特征的差別，并不會影響到基因水平的改變，其內在并不具有直接的關聯，這主要考慮基因水平的改變或者波動可能主要與患者腫瘤相關因子水平或者蛋白翻譯轉錄調控過程中的變化有關。本研究發現，EGRF突變組NSCLC患者的3年累積生存率為55.80%，高于野生型組NSCLC患者的33.50%（χ2=4.339，P＜0.05），提示EGRF突變組NSCLC患者的生存預后更好，生存率的改變可能與EGRF突變導致的NSCLC患者腫瘤細胞治療敏感性的改變、治療后腫瘤微環境的破壞或者腫瘤干細胞生物學活性的破壞等有關。Cox比例風險回歸分析結果也顯示，TNM分期高、有淋巴結轉移、分化程度為低分化、p53蛋白陽性表達是影響NSCLC患者預后的獨立危險因素（P＜0.05），EGFR19/21基因突變是影響NSCLC患者預后的保護因素（P＜0.05），進一步提示了EGRF突變對于NSCLC患者臨床預后的影響。臨床分期或者淋巴結轉移情況等臨床特征與患者生存預后的關系，主要考慮與其對于患者鄰近正常組織的直接性浸潤過程有關，而關于EGFR19/21基因突變或者p53蛋白的表達與患者生存預后的關系，則提示臨床上可以通過針對性沉默相關指標，進而改善治療結局。

綜上所述，本研究的創新性在于探討了EGFR19/21基因突變對于NSCLC患者生存預后的影響，揭示了EGFR19/21基因突變與NSCLC患者p53蛋白表達的內在關系。EGFR19/21基因突變NSCLC患者的p53蛋白呈高表達，其可能影響到多種生物學機制，進而參與到NSCLC的發病過程中。

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