超聲波輔助鹽溶法提取杏鮑菇蛋白的工藝優(yōu)化

郎田田，雷姝敏，陳紅

(揚(yáng)州大學(xué) 旅游烹飪學(xué)院 食品科學(xué)與工程系，江蘇 揚(yáng)州 225127)

杏鮑菇(Pleurotuseryngii) 的品質(zhì)非常優(yōu)良,具有良好的風(fēng)味、口感，并且含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。杏鮑菇的營(yíng)養(yǎng)功能性物質(zhì)含量豐富、脂肪含量較少，具有較高的研究?jī)r(jià)值，近年來(lái)對(duì)杏鮑菇功能性物質(zhì)的提取、開(kāi)發(fā)以及利用愈發(fā)火熱[2,3]。堿溶酸沉法是提取杏鮑菇蛋白較為常用的方法，雖然此方法蛋白提取率高，但提取的蛋白質(zhì)會(huì)因?yàn)樘崛∫菏菑?qiáng)堿而發(fā)生變性，蛋白的生物活性以及其利用價(jià)值會(huì)被影響[4]。

本試驗(yàn)是在上述背景的前提下進(jìn)行研究的,以杏鮑菇為原料,稀NaCl溶液為提取液,超聲波輔助提取杏鮑菇粗蛋白,以期獲得最佳的提取條件,可以提高杏鮑菇及杏鮑菇內(nèi)的功能性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇：購(gòu)于江蘇省徐州市豐縣；考馬斯亮藍(lán)、牛血清蛋白(BSA)、維生素C、NaCl：以上均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-756P 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;FD-A10N-50冷凍干燥機(jī) 上海皓莊儀器有限公司;SKD-100 凱式定氮儀 上海沛歐有限公司;電腦智能溫控低溫超聲波合成萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;J25立式低溫離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.3 方法

1.3.1 新鮮杏鮑菇的預(yù)處理方法

將杏鮑菇子實(shí)體用自來(lái)水清洗，室溫下晾干后切成體積為1 cm3的小塊，用液氮速凍后裝入保鮮袋中，保存于-80 ℃超低溫冰箱。將速凍后的杏鮑菇材料冷凍干燥，經(jīng)粉碎后過(guò)80目篩，保存于有硅膠的干燥皿中備用。

1.3.2 杏鮑菇蛋白提取的單因素試驗(yàn)[5,6]

1.3.2.1 NaCl溶液的濃度對(duì)蛋白提取率的影響

在杏鮑菇干粉和NaCl溶液的料液比為1∶40、溫度為40 ℃、超聲波功率為400 W的條件下,分別調(diào)整NaCl溶液的濃度為1%，2%，3%，4%，5%,反應(yīng)30 min后,測(cè)定蛋白質(zhì)提取率,確定最適初始NaCl溶液的濃度。

1.3.2.2 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響

在杏鮑菇干粉和NaCl溶液的料液比為1∶40、NaCl溶液的濃度為1%、超聲波輔助溫度為40 ℃、功率為400 W的條件下,反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為10～50 min,每檔間隔10 min，反應(yīng)結(jié)束后,測(cè)定蛋白質(zhì)提取率,確定最適初始反應(yīng)時(shí)間。

1.3.2.3 料液比對(duì)蛋白提取率的影響

在NaCl溶液的濃度為1%、超聲波輔助溫度為40 ℃、功率為400 W的條件下,設(shè)定杏鮑菇干粉和NaCl溶液的比例為1∶60，1∶50，1∶40，1∶30，1∶20,反應(yīng)30 min后,測(cè)定蛋白質(zhì)提取率,確定初始反應(yīng)的料液比。

1.3.2.4 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響

在杏鮑菇干粉和NaCl溶液的料液比為1∶40、NaCl溶液的濃度為1%、超聲波輔助功率為400 W的條件下,設(shè)定溫度為20～60 ℃,每檔間隔10 ℃，反應(yīng)30 min后,測(cè)定蛋白質(zhì)提取率,確定最適初始溫度。

1.3.2.5 超聲波功率對(duì)蛋白提取率的影響

在杏鮑菇干粉和NaCl溶液的料液比為1∶40、NaCl溶液的濃度為1%、超聲波輔助溫度40 ℃的條件下,設(shè)置超聲波功率為200～600 W,每檔間隔100 W，反應(yīng)30 min后,測(cè)定蛋白質(zhì)提取率,確定最適初始超聲功率。

1.3.3 杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率的測(cè)定

使用考馬斯亮藍(lán)法來(lái)對(duì)蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，參照Bradford的方法，并做相應(yīng)修改[7]。

杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率=提取液蛋白濃度×提取液體積原料質(zhì)量×原料總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)×100%。

1.3.4 響應(yīng)曲面優(yōu)化法[8]

1.3.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，料液比、提取溫度和提取功率是影響蛋白提取率最顯著的因素，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理設(shè)計(jì)了響應(yīng)面分析試驗(yàn)，具體因素、水平見(jiàn)表1。

表1 超聲波提取杏鮑菇蛋白響應(yīng)面分析因素和水平表Table 1 The factors and levels of response surface analysis of ultrasonic extraction for Pleurotus eryngii

1.3.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型的建立

使用Design Expert 7.0.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析,得到杏鮑菇蛋白提取率與料液比A、提取溫度B、提取功率C的真實(shí)值的二次回歸模型。

1.3.4.3 響應(yīng)曲面分析

在簡(jiǎn)化的回歸模型上，做料液比與溫度、料液比與功率、溫度和功率兩兩因素對(duì)杏鮑菇蛋白提取率影響顯著性的響應(yīng)曲面和等高線圖，另一個(gè)因素在零水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

2.1.1 NaCl濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

蛋白提取率隨著NaCl濃度變化的結(jié)果,見(jiàn)圖1。

圖1 NaCl濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 The effect of NaCl concentration on the extraction rate of protein

NaCl濃度在0～2%范圍時(shí),蛋白提取率隨著NaCl濃度的增加而增加,可能是由于離子濃度升高,導(dǎo)致蛋白表面電荷數(shù)增加,蛋白質(zhì)的溶解度也隨之增加;而NaCl濃度大于 2%時(shí),蛋白提取率卻有所降低,這可能是因?yàn)榈鞍妆砻娴碾姾蓴?shù)已經(jīng)達(dá)到飽和,高濃度NaCl的電離反而會(huì)打破蛋白分子和水分子之間的相互作用,降低蛋白的溶解性。因此,選擇 2%為初始最佳NaCl濃度。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

蛋白提取率隨著反應(yīng)時(shí)間變化的結(jié)果,見(jiàn)圖2。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 The effect of reaction time on the extraction rate of protein

當(dāng)反應(yīng)時(shí)間范圍在10～20 min時(shí),蛋白質(zhì)的提取率隨著時(shí)間的變長(zhǎng)而得以提高,這可能是因?yàn)槌暡〞?huì)使細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的振動(dòng),細(xì)胞壁被破壞,細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)入溶液,20 min恰好是細(xì)胞壁破壞的飽和時(shí)間;當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到30 min時(shí),蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到平衡,時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而會(huì)使提取率下降。因此,挑選20 min為初始超聲時(shí)間。

2.1.3 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

蛋白提取率隨著料液比變化的結(jié)果，見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 The effect of ratio of material to liquid on the extraction rate of protein

在料液比在1∶20～1∶30范圍時(shí),蛋白溶解率隨著料液比的降低而升高,可能原因是在較高料液比時(shí),提取液粘度過(guò)高阻礙了蛋白的溶解,當(dāng)料液比下降時(shí),提取液粘度和分子間作用力都有所下降,蛋白的溶解率提高;當(dāng)料液比低于1∶30 時(shí),對(duì)溶液進(jìn)行稀釋已經(jīng)不能提高蛋白的溶解率,達(dá)到穩(wěn)定的平衡狀態(tài)。因而,選取1∶30 為初始最佳提取料液比。

2.1.4 溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

蛋白質(zhì)提取率隨著溫度變化的結(jié)果，見(jiàn)圖4。

圖4 溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 The effect of temperature on the extraction rate of protein

提取溫度在20～50 ℃時(shí),蛋白溶解率會(huì)隨著溫度提高而明顯變高,當(dāng)提取溫度高于50 ℃時(shí),提取率反倒會(huì)有所降低。這種現(xiàn)象是因?yàn)闇囟壬吣軌蛟黾拥鞍踪|(zhì)在溶液中的溶解度,而溫度再次提高時(shí),蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)會(huì)產(chǎn)生反應(yīng),從而影響蛋白質(zhì)的提取率。因而，挑選50 ℃為初始提取溫度。

2.1.5 超聲波功率對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

蛋白質(zhì)提取率隨著功率的變化結(jié)果，見(jiàn)圖5。

圖5 超聲波功率對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 The effect of ultrasonic power on the extraction rate of protein

杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率在功率為400 W時(shí)最高,當(dāng)超聲波功率提高時(shí),溶解率先變高后不變。這是可能是因?yàn)楣β实脑黾蛹訌?qiáng)了細(xì)胞的振動(dòng)反應(yīng),細(xì)胞壁更容易被破壞,胞內(nèi)蛋白也更多的進(jìn)入提取液;當(dāng)功率高于400 W時(shí),細(xì)胞振動(dòng)反應(yīng)已經(jīng)飽和,不會(huì)提高蛋白溶解,反而可能會(huì)破壞已經(jīng)溶出的蛋白結(jié)構(gòu)。因此,選取400 W為后續(xù)試驗(yàn)功率。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果

超聲波提取杏鮑菇蛋白響應(yīng)面分析試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 超聲波提取杏鮑菇蛋白響應(yīng)面分析試驗(yàn)的結(jié)果Table 2 Pleurotus eryngii response surface analysis results with ultrasonic extraction

續(xù) 表

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型的建立

利用Design Expert 7.0.0軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到杏鮑菇蛋白提取率與料液比A、提取溫度B、提取功率C的真實(shí)值的二次回歸模型為Y=53.37+4.85A+2.53B-1.09C+5.92AB-0.78AC-1.38BC-13.83A2-5.70B2-2.22C2。

回歸模型的方差分析結(jié)果,見(jiàn)表3。

表3 回歸方程模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation model

注：決定系數(shù)R2=0.9969,調(diào)整決定系數(shù)adj-R2=0.9930;*為差異顯著(P<0.05)；**為差異極顯著(P<0.01)。

模型P<0.0001,表明具有極顯著性差異,說(shuō)明不同提取條件下,杏鮑菇蛋白的提取率有顯著性差異;在本試驗(yàn)所選因素水平內(nèi)，對(duì)提取率的影響次序?yàn)锳>B>C,即料液比>提取溫度>超聲功率;A，B對(duì)模型具有極顯著性影響(P<0.01),C因素有顯著影響。各因素的交互項(xiàng)AB影響極顯著,表明提取溫度和料液比對(duì)杏鮑菇蛋白提取有極顯著性影響,AC對(duì)模型有顯著性影響，BC對(duì)模型影響不顯著;二次項(xiàng)A2，B2，C2對(duì)模型具有極顯著的影響。

2.2.3 響應(yīng)曲面分析

各個(gè)因素交互的響應(yīng)曲面和等高線圖見(jiàn)圖6～圖8。

圖6 料液比與溫度兩因素及其交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 The response surface and contour plot ofratio of material to liquid and temperature and the interaction

圖7 料液比與功率兩因素及其交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 The response surface and contour plot of ratio of material to liquid and power and the interaction

圖8 溫度和功率兩因素及其交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 The response surface and contour plot of temperature and power and the interaction

由圖6可知，沿溫度和料液比方向的等高線密集程度、曲面陡峭程度相當(dāng),均較密集或陡峭,闡明這兩種因素對(duì)提取率產(chǎn)生的影響相當(dāng),且均為顯著性影響。在提取溫度57 ℃、料液比1∶38 (g/mL)有峰值,杏鮑菇蛋白提取率最高。由圖7可知,沿料液比方向比沿功率方向等高線密集,曲面陡峭,說(shuō)明料液比能夠?qū)π吁U菇蛋白的提取率產(chǎn)生顯著的影響。在提取料液比1∶38 (g/mL)、功率337 W時(shí)有峰值,杏鮑菇蛋白提取率最高。由圖8可知,沿功率方向比沿溫度方向等高線稀疏,表明溫度對(duì)杏鮑菇蛋白提取率產(chǎn)生顯著的影響。在提取溫度 57 ℃、功率337 W時(shí)有峰值,杏鮑菇蛋白提取率最高。

2.2.4 杏鮑菇蛋白提取工藝

在NaCl濃度2%、提取時(shí)間20 min、提取溫度57 ℃、料液比1∶38、超聲波功率340 W條件下提取率最高。過(guò)3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，蛋白質(zhì)平均提取率為57.9%，工藝穩(wěn)定。

3 結(jié)論與展望

3.1 結(jié)論

本試驗(yàn)以杏鮑菇為原料,超聲波輔助鹽溶法提取杏鮑菇粗蛋白。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出以下結(jié)論：在NaCl濃度2%、提取時(shí)間20 min、提取溫度57 ℃、料液比1∶38、超聲波功率340 W條件下提取率最高，為57.9%。

3.2 展望

杏鮑菇的子實(shí)體提取物已被證實(shí)具有許多重要的生物活性,例如抗氧化活性、抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)活性等[9,10]。通過(guò)本次研究,獲得了超聲波輔助鹽析法提取杏鮑菇蛋白的最佳條件,這種提取工藝條件較為溫和,不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能有較大的破壞,為今后杏鮑菇蛋白生物活性的研究提供了更多的可能,可以提高杏鮑菇及杏鮑菇內(nèi)的功能性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用[11]。

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