東坡肘子揮發性成分萃取方法的選擇及優化

劉陽，吳華昌，鄧靜，易宇文，喬明鋒，彭毅秦

(1.四川旅游學院 食品學院，成都 610100；2.四川旅游學院 烹飪科學 四川省高等學校重點實驗室，成都 610100)

東坡肘子是傳統的經典川菜代表之一，其以其色、香、味、形俱全著名于國內外，且富含大量膠原蛋白，是保持皮膚豐滿潤澤、強體增肥的食療佳品，有人稱其為“美容食品”，外賓贊頌它可列入世界名菜[1]。

東坡肘子的風味物質是由很多復雜混合物交織在一起形成的，其主要是由東坡肘子加工過程中添加的食鹽、糖類、老抽等調味品以及肉中的風味前體物質，包括瘦肉組織和脂肪組織之間的脂肪酸、氨基酸和硫胺素的熱分解以及糖類和氨基酸之間的美拉德反應產生的風味物質決定的[2,3]。隨著科研工作者對肉制品不斷深入研究，已發現肉制品的風味物質涵蓋了大多數的有機化合物，包括碳烴化合物、醇、醛、酯、酮、羧酸、醚、呋喃、吡啶、吡咯、噻唑、噻吩以及其他的含硫含氮化合物。其中最重要的呈香物質是呋喃、噻唑、吡嗪、吡咯、吡喃酮等含氮、氧、硫的雜環化合物以及含有羧基的揮發性物質[4-8]。東坡肘子作為傳統川菜，其以豬肘為原料，采用特殊的烹飪工藝會形成非常豐富的風味成分。一般來說，這些風味物質的形成途徑有脂質的熱降解[9]、氨基酸和多肽的熱降解[10]、硫胺素的熱降解[11]、糖類與氨基酸之間的美拉德反應等[12，13]。食品的揮發性化合物決定了食品的香氣特征并對其特征風味有著巨大的貢獻，在食品消費時，香氣通常影響消費者對食物的評價。如何快速、準確地萃取出食品中的揮發性風味成分，是食品香氣進一步研究的重點。

頂空固相微萃取法是在固相萃取的基礎上發展起來的新型萃取分離技術，該技術與其他萃取方式相比，具有不使用溶劑、操作簡單、檢測快速等優點，可以更好地分析食品中的揮發性成分。頂空固相微萃取受萃取頭類型、萃取時間、萃取溫度、樣品質量濃度、頂空體積、攪拌、pH值等因素的影響。本實驗主要采用正交設計法對頂空固相微萃取的諸多影響因素，如萃取頭、萃取時間、萃取溫度等進行優化，為東坡肘子揮發性成分的快速檢測及進一步分析研究提供一定的技術保證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

東坡肘子：四川王家渡食品有限公司。

1.2 主要儀器

手動SPME進樣器，50/30 μm DVB/CAR/PDMS，65 μm PDMS/DVB，75 μm CAR/PDMS，100 μm PDMS萃取頭，Agilent 7890A氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司；SHP0201147047電子天平 奧豪斯儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 GC-MS檢測條件

色譜條件：毛細管色譜柱Agilent HP-INNOWax(60 m×250 μm，0.25 μm)；手動無分流進樣，進樣口溫度230 ℃；程序升溫：初始溫度45 ℃，保留3 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保留5 min；檢測器溫度230 ℃；載氣He，流速1 mL/min。

質譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，掃描范圍10～550 u，離子源溫度230 ℃，接口溫度230 ℃。

1.3.2 東坡肘子樣品處理方式的選擇

將東坡肘子切碎至1 cm3大小，稱取2.5 g加入到15 mL樣品瓶中，同時量取2.5 mL東坡肘子的湯汁于樣品瓶中，密封備用。

將東坡肘子切碎至1 cm3大小，稱取5 g加入到15 mL樣品瓶中，密封備用。

將東坡肘子切碎至1 cm3大小，稱取2.5 g加入到15 mL樣品瓶中，同時量取2.5 g 20%氯化鈉溶液，密封備用。

稱取5 g東坡肘子湯汁，加入到15 mL樣品瓶中，密封備用。

將準備好的樣品瓶放入75 ℃水浴加熱，然后將SPME萃取頭插入樣品瓶中，在一定條件下進行萃取，然后在氣相色譜進樣口250 ℃解吸2 min，采用GC-MS分析揮發性風味成分。

1.3.3 頂空固相微萃取單因素條件優化

1.3.3.1 萃取頭的選擇

取2.5 g處理好的東坡肘子、2.5 g湯汁加入至15 mL樣品瓶中。采用4種不同涂層厚度的萃取頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS，65 μm PDMS/DVB，75 μm CAR/PDMS和100 μm PDMS，在60 ℃水浴中平衡5 min后保溫萃取45 min，萃取結束后將萃取頭移入GC-MS進樣口解吸5 min。

1.3.3.2 萃取溫度的選擇

控制其他條件不變，分別在40，50，60，70，80 ℃的條件下，用75 μm CAR/PDMS萃取頭萃取45 min。

1.3.3.3 萃取時間的選擇

控制其他條件不變，用75 μm CAR/PDMS萃取頭在60 ℃下分別萃取30，40，50，60，70 min。

1.3.4 正交試驗設計

正交設計是利用正交表來安排與分析多因素試驗的一種設計方法，其選擇全部試驗水平組合中部分具有代表性的水平組合進行試驗，通過分析這部分試驗結果數據從而解析全部試驗組合的整體情況，然后找出最佳試驗組合。根據單因素試驗結果及國內外文獻得到影響東坡肘子揮發性化合物萃取效率的主要因素為萃取頭涂層厚度(A)、萃取時間(B)、萃取溫度(C)。各因素選擇3個水平分別為：A1(50)，A2(65)，A3(75)；B1(45)，B2(60)，B3(75)；C1(55)，C2(65)，C3(75)。本次正交試驗設計根據萃取物種類和色譜總峰面積的變化考察東坡肘子揮發性化合物的萃取效率。

1.3.5 驗證試驗

以正交試驗得到的最優條件作為萃取條件重復試驗。

1.3.6 數據分析方法

試驗數據處理由GC-MS數據分析軟件系統完成，未知化合物經計算機檢索同時與NIST、RTLPEST 2個譜庫相匹配，僅當匹配度大于800(最大值為1000)的鑒定結果才予以報道。采用峰面積歸一化法定量計算出各揮發性成分在東坡肘子中的相對含量[14]。

利用Origin 8.5進行單因素試驗數據的作圖分析；IBM SPSS Statistics 19.0用于正交試驗設計與數據分析。

2 結果與分析

2.1 東坡肘子樣品處理方式的選擇

本試驗采用4種不同取樣方式對東坡肘子揮發性成分進行萃取分析比較，選取最佳取樣方式。4種取樣方式萃取得東坡肘子揮發性成分的GC-MS總離子流色譜圖，見圖1～圖4。萃取的揮發性物質成分見表1。

圖1 2.5 g汁、肉萃取的總離子流色譜圖Fig.1 The total ion current chromatogram of 2.5 g juice and 2.5 g meat

圖2 5 g肉萃取的總離子流色譜圖Fig.2 The total ion current chromatogram of 5 g meat

圖3 2.5 g肉和氯化鈉溶液萃取的總離子流色譜圖Fig.3 The chromatogram of 2.5 g meat and sodium chloride solution

圖4 5 g肘子湯汁萃取的總離子流色譜圖Fig.4 The total ion current chromatogram of 5 g juice

序號種類保留時間(min)匹配項名稱中文名稱相對百分含量(%)12341酯類5.421Ethyl Acetate乙酸乙酯0.278.39-1.00212.849Butanoicacid,3-methyl-,1-ethenyl-1,5-dimethyl-4-hexenyl ester3-甲基-丁酸-1-乙基-1,5-二甲基-4-己烯酯0.27---316.3451,5-Dimethyl-1-vinyl-4-hexenylbutyrate丁酸-1-乙烯基-1,5-二甲基-4-己烯基酯---0.67417.603Butyrolactone gamma-丁內酯-0.15--518.7842,6-Octadien-1-ol, 3,7-dimethyl-, acetate, (E)-乙酸香葉酯4.42--3.226醇類6.239Ethyl alcohol乙醇0.470.59-0.28711.8991-Pentanol1-戊醇-1.973.02-812.9882-Heptanol2-庚醇0.30---913.5111-Hexanol正己醇-1.905.49-1014.8621-Octen-3-nol1-辛烯-3-醇-2.433.43-1114.9651-Heptanol庚醇--0.84-1215.4041-Hexanol, 2-ethyl-2-乙基己醇-0.70--1316.1461,6-Octadien-3-ol, 3,7-dimethyl-芳樟醇1.20-0.081.471417.1144-methyl-1-(1-methylethyl)-4-萜烯醇0.22--0.221517.6062-Cyclohexen-1-ol2-環己烯-1-醇0.69---1618.352Isoborneol異龍腦0.44--0.331719.8552,6-Octadien-1-ol, 3,7-dimethyl-香葉醇0.60--0.731820.965Phenylethyl Alcohol苯乙醇0.87--0.881922.6121,6,10-Dodecatrien-3-ol,3,7,11-trimethyl-橙花叔醇0.10--0.1320烴類6.398Cyclooctene環辛烯-0.87--217.727α-Pineneα-蒎烯0.62--1.30228.025Toluene甲苯-1.69--238.661Camphene莰烯0.660--0.252410.204p-Xylene對二甲苯-0.50--2510.9074-Carene4-蒈烯1.519--1.272610.479.beta.-Myrcene月桂烯9.92--9.812711.215D-Limonene右旋萜二烯5.90--5.402811.359Bicyclo[3.1.0]hex-2-ene,4-methyl-1-(1-methylethyl)-崖柏烯---6.692911.3973-methylene-6-(1-methylethyl)-Cyclohexene3-亞甲基-6-(1-甲基乙基)環己烯6.57---3011.9841,3,6-Octatriene, 3,7-dimethyl-羅勒烯1.71--1.253112.393Benzene, 1-methyl-2-(1-methylethyl)-鄰異丙基甲苯-1.552.232.083212.426Benzene, 1-methyl-4-(1-methylethyl)-4-異丙基甲苯2.89---3313.096Benzene, butyl-丁苯0.18--0.153414.2442,4,6-Octatriene,2,6-dimethyl-, (4E,6E)-(E,E)-2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯0.95---3514.907Benzene, 1-methyl-4-(1-methylethenyl)-2,4-二甲基苯乙烯4.261.221.422.143615.803a-Copaeneα-胡椒烯0.62---3717.6742,6-Octadiene, 2,6-dimethyl-2,6-二甲基-2,6-辛二烯1.15---3817.911Benzene, 2-ethyl-1,4-dimethyl-2-乙基對二甲苯--1.21-3917.9441H-3a,7-Methanoazulene,octahydro-3,8,8-trimethyl-6-methylene-, (3R,3aS,7S,8aS)-柏木烯1.08---4017.951Benzene, 1-ethyl-3,5-dimethyl-5-乙基-3,5-二甲基苯---0.954118.6121-methyl-4-(5-methyl-1-methylene-4-hexenyl)-紅沒藥烯1.916---4219.0681-(1,5-dimethyl-4-hexenyl)-4-methyl-Α-姜黃烯11.64--9.214320.067l-Calamenene去氫白菖烯0.62---4420.476Benzene, 1-methyl-3-(1-methylethyl)-間異丙基甲苯---0.18

續 表

注：“-”表示未檢測到該種物質。

由表1可知，東坡肘子樣品選擇不同的處理方式，其檢測到的化合物種類及含量存在較大差異。采用東坡肘子湯汁與肉混合取樣方式檢測到的揮發性化合物最多，共檢測到45種揮發性化合物，其中酯類3種、醇類9種、烯類16種、醛類6種、酮類4種、醚類1種、酚類3種、呋喃類及含N、S類物質各3種；取東坡肘子湯汁進行GC-MS檢測，共檢測到44種化合物，同時其檢測到揮發性化合物與東坡肘子肉、汁混合取樣無明顯差異，由圖1～圖4可知，其總離子流圖差異很小；取東坡肘子肉進行GC-MS檢測，共檢測到25種物質，在相同條件下，加入氯化鈉溶液增加其離子濃度，檢測得到的物質種類只有23種，造成該結果的原因可能是東坡肘子在加工過程中經歷長時間蒸煮過程，部分香氣物質逸散至湯汁中，同時，東坡肘子的香氣物質還有很大一部分是來自于東坡肘子的調味料所致。由表1可知，東坡肘子湯汁、肉混合取樣方式檢測到的揮發性化合物主要組分有：乙酸香葉酯、芳樟醇、糠醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、5-甲基呋喃醛、反式-2,4-癸二烯醛、檸檬醛、3-羥基-2-丁酮、l-甲基庚烯酮、2-壬酮、甲基壬基甲酮、2-正戊基呋喃、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-乙酰基吡咯，這些物質大多數對東坡肘子的風味有著一定貢獻。綜合考慮，本次研究選取東坡肘子肉、汁混合取樣方式進行后續研究。

2.2 頂空固相微萃取單因素條件優化

2.2.1 萃取頭的選擇

不同涂層厚度的萃取頭，其合成材料不同，導致萃取頭的極性不同[15]，從而對不同物質的吸附能力不同。100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)固相微萃取頭對非極性半揮發性化合物有較強的吸附能力[16]；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)固相微萃取頭對于揮發性和半揮發性C3-C20的香味物質吸附力較強；65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)固相微萃取頭可以用于揮發性物質、胺類、硝基芳香類化合物的吸附；75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)固相微萃取頭主要用于吸附氣體和小分子量化合物[17，18]。由于東坡肘子揮發性風味成分種類繁多，性質各異，因此有必要比較以上4種萃取頭對東坡肘子揮發性風味成分萃取效果的影響。為此，以50/30 μm DVB/CAR/PDMS(吸附條件：萃取溫度65 ℃、萃取時間75 min、萃取質量5 g)、65 μm PDMS/DVB(吸附條件：同上)、75 μm CAR/PDMS(吸附條件：同上)、100 μm PDMS(吸附條件：同上)為萃取頭，初步測定了東坡肘子中的揮發性物質，結果見表2。

表2 4種萃取頭的萃取結果Table 2 The extraction results of four extraction fibers

續 表

注：“-”表示未檢測到該種物質。

由表2可知，4種萃取頭共萃取出53種揮發性化合物，其中75 μm CAR/PDMS萃取頭檢測到的揮發性風味成分的種類和色譜總峰面積最大，其次是65 μm PDMS/DVB萃取頭，最后是100 μm PDMS萃取頭。75 μm CAR/PDMS萃取頭分別檢測出烴類11種、醛類5種、醇類10種、酮類2種、醚類2種、呋喃及含N、S類物質6種，多于其他3種萃取頭萃取的物質，因此，本次研究選用75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)固相萃取頭進行后續研究。

2.2.2 萃取溫度的選擇

萃取溫度對東坡肘子揮發性化合物的萃取效率受兩方面因素影響，隨著溫度升高，樣品分子運動加速，氣相中揮發性成分含量會逐漸增加，吸附效率隨之提高，同時可縮短萃取平衡時間；另一方面，溫度升高會降低萃取頭涂層中分析物的分配系數[19]。因此，最佳萃取溫度的選擇需要考慮這兩方面的因素。

圖5 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction effect

由圖5可知，在60 ℃之前，隨萃取溫度的升高，萃取物的種類及色譜總峰面積均快速增加；在60～70 ℃之間時，萃取物種類及色譜總峰面積均變化不大；當溫度超過80 ℃時，色譜總峰面積雖有所增加，但萃取物種類減少，這可能是由于東坡肘子中的部分不穩定揮發性物質在高溫下被分解以及萃取頭涂層中分析物的分配系數降低這兩個原因造成的，故本次研究選取60 ℃作為最佳萃取溫度。

2.2.3 萃取時間的選擇

萃取時間對東坡肘子萃取效率的影響主要指達到或接近平衡時所需要的時間，其主要由萃取頭、分配系數、樣品擴散系數、頂空體積及萃取溫度等因素綜合作用決定[20]。萃取開始時萃取頭吸附量迅速增加，接近或達到平衡時吸附速度極其緩慢，而達到平衡后，萃取頭上易揮發物質會被解吸，使吸附量下降，因此，需在萃取達到或接近平衡之前結束萃取過程。萃取時間對東坡肘子萃取效率的影響見圖6。

圖6 萃取時間對萃取效果的影響Fig.6 Effect of extraction time on extraction effect

由圖6可知，萃取時間為60 min時，萃取物種類最多且色譜總峰面積最大；萃取時間達到70 min時，萃取物種類和色譜總峰面積均有所降低，表明萃取60 min時已達平衡；在70 min時萃取頭上易揮發物質已被解吸。故本次研究選取60 min作為最佳萃取時間。

2.3 正交試驗設計

根據單因素試驗結果選取的3個因素，按照正交試驗設計原理，選取3個水平，得到正交設計試驗結果及分析，見表3。

表3 正交試驗結果及分析Table 3 The orthogonal experimental results and analysis

從正交試驗9個處理中直觀找出最優組合為8號處理樣，即A3B1C2，試驗指標為化合物種類67種、色譜總峰面積1.9262(×1010)；其次是7號和5號處理樣，分別為A3B3C1和A2B3C2，試驗指標分別為7號化合物種類58種、色譜總峰面積1.5585(×1010)，5號化合物種類51種、色譜總峰面積1.8857(×1010)。對正交試驗結果和試驗指標進行直觀分析驗證得到表3所示結果。由表3可知，由萃取得到的化合物種類考察萃取效果時，其涂層厚度所在因素列的極差R最大，表明萃取頭涂層厚度的水平變化對試驗指標的影響度最大，其次是萃取時間對試驗指標的影響，而溫度對其影響相對較小；由萃取得到的色譜總峰面積考察萃取效果時，其萃取溫度所在因素列極差R最大，其次是涂層厚度，極差最小的為萃取時間。

表4 正交試驗方差分析表Table 4 Table of variance analysis of orthogonal experiment

由表4可知，萃取頭涂層厚度和萃取時間2個因素對萃取具有顯著影響，而萃取溫度對其的影響較小，因此，選出最佳實驗條件為A3B2C2，即萃取頭涂層厚度為75 μm，萃取時間為60 min，萃取溫度為65 ℃。由于選出的最佳實驗條件與實際最優水平組合實驗條件不一致，因此需要對2個實驗條件進一步進行驗證。

2.4 最優萃取條件驗證性實驗

由正交試驗選出的最佳實驗條件A3B2C2以及其實際最佳條件A3B1C2對東坡肘子揮發性成分進一步萃取，得到其萃取結果見表5。

表5 東坡肘子的GC-MS分析Table 5 GC-MS analysis of Dongpo elbow

續 表

注：“-”表示未檢測到該種物質。

由表5可知，采用正交試驗得到的最優萃取組合和利用正交分析得到的最佳萃取條件對東坡肘子進行GC-MS分析，共檢測出44種揮發性物質，其中以條件A3B2C2(即萃取頭涂層厚度為75 μm，萃取時間為60 min，萃取溫度為65 ℃)萃取得到45種化合物，其中3種酯類化合物、11種醇類化合物、17種烯烴類化合物、5種醛類物質、2種酮類物質、3種呋喃類物質及3種含氮硫類物質和1種酸類物質；以條件A3B1C2(即萃取頭涂層厚度為75 μm，萃取時間為45 min，萃取溫度為65 ℃)萃取得到34種化合物，其中2種酯類物質、8種醇類物質、13種烯烴類化合物、5種醛類物質、3種酮類物質、2種呋喃及含氮硫類物質和1種酸類物質。兩種萃取得到揮發性化合物類別一樣，但以45 min為萃取時間得到的化合物種類及總量均比在60 min萃取條件下得到的少，且總峰面積最大的是60 min萃取條件下得到的色譜圖，因此，本次研究選取最佳實驗條件為A3B2C2，即萃取頭涂層厚度為75 μm，萃取時間為60 min，萃取溫度為65 ℃。

3 結語

本研究從樣品處理對萃取效果的影響和正交設計優化萃取條件兩個方面對東坡肘子揮發性風味成分的萃取條件進行研究，結果表明：對萃取樣品采用不同的處理方式，萃取效果存在較大差異，東坡肘子成品風味由其湯汁和原料共同構成，采用東坡肘子湯汁與原料混合取樣方式比單獨選取其原料或湯汁萃取得到的化合物種類及含量多。采用正交設計試驗對揮發性風味成分萃取條件進行優化研究，通過直觀分析和方差分析得出其最佳萃取條件為:75 μm CAR/PDMS萃取頭、萃取時間60 min、萃取溫度65 ℃。采用最佳萃取條件檢測王家渡東坡肘子香氣成分，共得出45種揮發性風味物質，包括酯類、醇類、烴類、醛類、酮類、呋喃及含氮硫物質以及酸類物質，且化合物種類及總峰面積均遠大于其他萃取條件。

東坡肘子作為具有悠久歷史的傳統名菜，現已經實現工業化生產，同時也帶來了巨大的經濟效益。風味是東坡肘子品質鑒定最重要的指標，但其評價方法均為各生產廠家根據國家食品標準制定的品質檢測方法，這些方法受人為因素影響較大且沒有統一的評價標準，造成當前市場各東坡肘子價格存在一定的差異，其風味各異。因此，通過研究可為東坡肘子揮發性成分的快速檢測及進一步分析研究提供一定的技術保證。

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