響應面法優化復合酶酶解制備風味大豆肽

張麗華

(1.大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連 250353；2.赤峰工業職業技術學院教務處，內蒙古 赤峰 024005)

風味肽是蛋白質經水解后產生的呈味小分子肽或一定分子量的小肽與還原糖的美拉德反應產物，能顯著改善食品的鮮味、持續感和醇厚味，是一些醬油及豆醬類調味品中的主要呈味物質[1]。近年來，肽的呈味功能受到各國學者的廣泛關注[2]，其較強的呈味特性，也為風味料的開發提供了優良的底物和前體。

大豆是重要的糧食作物之一，在我國已有5000多年的種植歷史。大豆中蛋白含量高達40%，是一種優質的植物蛋白[3]。且大豆蛋白水解物中氨基酸含量豐富，水解產物質量穩定，是美拉德風味肽開發的理想原料。但是，大豆蛋白在不同蛋白酶作用下，生成的酶解產物在美拉德反應中呈味性不同。文章以大豆分離蛋白為原料，通過不同酶水解，并將水解產物進行美拉德反應，以水解度和美拉德反應后產物的呈味感官評分為指標，篩選2種蛋白酶進行復合酶解，并通過響應面分析法對復合酶解條件進行優化，以期獲得最佳的風味大豆肽酶解工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白：山東禹王生態食業有限公司；堿性蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶：丹麥諾維信公司；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶：杰能科(中國)生物工程有限公司；鹽酸、NaOH等化學試劑：均為分析純。

酸度計 科伲可(上海)電子測量儀器貿易有限公司；電子恒溫水浴鍋 上海一科儀器有限公司；電子分析天平 上海京孚儀器有限公司；真空冷凍干燥機 美國Labconco公司；CR-21G型高速冷凍離心機 Hitachi日本日立有限公司；K9860全自動凱氏定氮儀 海能(濟南)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基本成分的測定

蛋白酶活力的測定：依照QB/T 1803-1993進行；蛋白質含量的測定：依照GB 5009.5-2010進行；水分的測定：依照GB 5009.3-2010進行；灰分的測定：依照GB 5009.4-2010進行；脂肪的測定：依照GB 5009.6-2016進行。

1.2.2 大豆分離蛋白的酶解

稱取20.0 g大豆分離蛋白，加入適量的去離子水，配制成一定濃度的大豆分離蛋白混合液，80 ℃恒溫水浴30 min，降至室溫。加入一定量的蛋白水解酶，調節一定的pH、溫度和酶解時間進行酶解，然后于90 ℃滅酶10 min，冷卻后于3000 r/min離心30 min，取上清液冷凍干燥，即為大豆分離蛋白酶解物。

1.2.3 蛋白質水解度(DH)的測定

依據文獻[4]采用甲醛滴定法進行。

1.2.4 美拉德反應

取適量的大豆肽，配制成一定濃度的大豆肽溶液，添加一定量木糖混合均勻，用NaOH溶液調節pH至7.4，轉移密閉至反應器中，在110 ℃下以一定攪拌速度加熱反應120 min，反應結束后，冰水迅速冷卻，即為風味大豆肽。

1.2.5 感官評定方法

依照鮮味評定，參考Ogasawara等的方法[5]。在純凈水中加入1.0%的谷氨酸鈉和0.5%的NaCl，攪拌均勻。加入0.5%的樣品作為品嘗對象，在60 ℃恒溫水浴10 min，以麥芽糊精代替樣品溶液作為對照組，進行感官評定。評定小組由 20位專業人員組成，打分采用7分制，將麥芽糊精的對照溶液設定為3分。評定內容為鮮味、醇厚味、持續味、焦甜味、酸味和苦味，感官評價總分參照下列公式計算：

P=∑ni=1aixi。

式中：P為感官評價總得分；n為評價指標數目；a為權重系數；x為評價指標得分。其中權重系數a[6]見表1。

表1 綜合評分權重系數Table 1 Weighting coefficients of comprehensive scores %

最終得到酶解后樣品的感官評分為20位專業感官評分員的平均分。

2 結果與討論

2.1 基本成分及酶活力分析

2.1.1 大豆分離蛋白的基本成分

本文首先對原料大豆分離蛋白進行了基本成分測定，經測定，大豆分離蛋白中各組分含量見表2。

表2 大豆分離蛋白的主要成分Table 2 Main components of soy protein isolate(SPI) %

2.1.2 幾種蛋白酶的活力分析

購買的不同種類的蛋白酶在運輸、儲存及使用過程中，會受到環境的影響，造成酶活力的損失，為了更準確地比較酶解效果，本文對購買的蛋白酶進行了酶活的測定，測定結果見表3。

表3 不同蛋白酶的活力Table 3 Activities of different proteases U/g

2.2 不同蛋白酶對大豆分離蛋白水解度的影響

在各蛋白酶的最適酶解條件下對大豆分離蛋白進行充分酶解，最后測得的蛋白酶水解度見圖1。

圖1 蛋白酶種類對水解度(DH)的影響Fig.1 Effects of protease types on DH

由圖1可知，木瓜蛋白酶的水解度最低，僅為3.9%，而堿性蛋白酶的水解度最高，達到27.1%，能更好地將大豆分離蛋白分解為小分子的多肽和氨基酸，而多肽和氨基酸正是美拉德反應制備風味基料的前體物[7]。因此，為了得到更高的多肽和氨基酸得率，本文選擇堿性蛋白酶作為復配復合酶中的一種。

2.3 復合酶的篩選

2.3.1 復合酶種類的篩選

分別將木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶與堿性蛋白酶按相同的酶活比例進行復配，用復配后的復合酶對大豆分離蛋白進行酶解，對酶解后的產物進行美拉德反應，對反應后的風味大豆肽進行感官評分，評分結果見圖2。

圖2 不同酶復合對風味感官評分的影響Fig.2 Effects of different complex enzymes on flavor sensory score

由圖2 可知，風味蛋白酶和堿性蛋白酶復配酶解后制備的風味大豆肽的風味感官評定最好，復合蛋白酶、木瓜蛋白酶次之，中性蛋白酶和堿性蛋白酶復配后最差。因此，本文選擇風味蛋白酶和堿性蛋白酶復配作為復合酶，來酶解大豆分離蛋白。

2.3.2 復合酶復配比例的篩選

堿性蛋白酶和風味蛋白酶復配時，酶解液美拉德反應后制備的大豆風味肽的風味最好，為了更好地確定2種酶的復配比例，本文將風味蛋白酶和堿性蛋白酶按0.2∶1.0，0.4∶1.0，0.6∶1.0，0.8∶1.0，1.0∶1.0，1.2∶1.0，1.4∶1.0，1.6∶1.0，1.8∶1.0的酶活比例進行復配，用復配后的復合酶對大豆分離蛋白進行酶解，來探究雙酶復配比例對感官評分的影響，見圖3。

圖3 復合酶復配比例對風味的影響Fig.3 Effects of ratios of complex enzymes on flavor

由圖3可知，隨著復合酶中風味蛋白酶酶活比例的升高，制備的風味大豆肽的感官評分呈現先升高后下降的趨勢，當風味蛋白酶和堿性蛋白酶的酶活比例為0.8∶1.0時，制備的風味大豆肽的感官評分最高，為4.21。這是因為當風味蛋白酶比例較低時(0.2～0.8)，風味蛋白酶的外切作用發揮明顯，能顯著改善酶解液中呈味氨基酸和多肽的組成，從而提高酶解液美拉德反應后的風味[8]。當風味蛋白酶比例較高時(0.8～1.8)，堿性蛋白酶比例降低，其所起的水解作用減弱，蛋白質水解度隨之降低，呈味氨基酸和多肽的含量降低，從而減弱了酶解液美拉德反應后的風味[9]。因此，選擇風味蛋白酶和堿性蛋白酶比例0.8∶1.0為復合酶中2種酶的復配比例。

2.4 雙酶復合酶解條件的單因素實驗

當風味蛋白酶和堿性蛋白酶比例為0.8∶1.0時，經美拉德反應制備的風味大豆肽的風味最好，因此，本文選擇的復合酶為風味蛋白酶和堿性蛋白酶2種酶復配而成，且其復配比例為風味蛋白酶∶堿性蛋白酶為0.8∶1.0(以酶活計)。

2.4.1 酶解溫度對風味的影響

圖4 酶解溫度對風味的影響Fig.4 Effects of enzymolysis temperature on flavor

由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，制備的風味大豆肽的感官評分不斷增加，當酶解溫度為50 ℃時，感官評分最高，達到4.24，這是因為在較低酶解溫度范圍內，隨著酶解溫度增加，2種酶的酶解活力不斷升高，酶解作用加強，堿性蛋白酶發揮其強水解作用，使酶解物中氨基酸和多肽的濃度不斷增加，風味蛋白酶的脫苦及風味改善作用也越來越強，使酶解液中呈味的氨基酸和多肽的種類和含量均不斷增加，進而使得制備的風味大豆肽的風味評分較高[10]。而當酶解溫度超過50 ℃時，隨著酶解溫度的不斷升高，最終的感官評分不斷下降，這是因為當溫度處于較高范圍時，隨著酶解溫度的不斷升高，堿性蛋白酶的酶活相對減弱，其強水解作用降低，導致最終酶解液中各類氨基酸和多肽的濃度降低，進而影響了最終酶解液美拉德反應后的感官評分。因此，選擇酶解溫度50 ℃為單因素實驗的最適酶解溫度。

2.4.2 酶解pH對風味的影響

圖5 pH對風味的影響Fig.5 Effects of pH value on flavor

由圖5 可知，隨著pH不斷增加，美拉德反應制備的風味大豆肽的感官評分呈現先升高后降低的趨勢。當pH為5.0時，感官評分最低，為3.28；當pH為7時，風味大豆肽的感官評分最高，為4.54；當pH>7.0時，隨著pH的增加，感官評分不斷降低，最后當pH為11時，感官評分為3.52。這是因為當pH為7.0時，一方面風味蛋白酶和堿性蛋白酶的酶活均相對較高，酶解作用較強；另一方面在該pH值下，大豆分離蛋白中一些特定的氨基酸基團暴露在外面，有利于風味蛋白酶的內外切同時作用，能進一步發揮風味蛋白酶的脫苦和改善風味作用[11]。因此，選擇pH 7.0為單因素實驗的最適酶解pH。

2.4.3 酶解時間對風味的影響

圖6 酶解時間對風味的影響Fig.6 Effects of enzymolysis time on flavor

由圖6可知，當酶解時間為0.5 h時，此時2種酶的作用較短，酶切作用較弱，產生的游離氨基酸和小分子呈味多肽較少，因此，美拉德反應制備的風味大豆肽的感官評分較低。隨著酶解時間的不斷延長，最終的感官評分不斷升高，酶解時間達到2.5 h時，風味大豆肽的感官評分達到4.74，當酶解時間繼續延長，風味大豆肽的感官評分趨于穩定，不再繼續升高。這是因為此時酶解時間已足夠長，在2種酶的復合酶解作用下，大豆分離蛋白中可以被切割的作用位點已經被作用完畢，繼續增加酶解，對游離氨基酸和小分子呈味多肽的貢獻不大。因此，本著降低能耗的原則，選擇2.5 h作為單因素實驗的最適酶解時間。

2.4.4 加酶量對風味的影響

圖7 加酶量對風味的影響Fig.7 Effects of enzyme dosage on flavor

由圖7可知，隨著加酶量的不斷增加，制備的風味大豆肽的感官評分呈現先增加后趨于平穩的趨勢。當加酶量為500 U/g時，感官評分最低，僅為3.65，隨著加酶量的不斷增加，感官評分不斷升高；當加酶量達到2000 U/g時，感官評分達到4.86，之后再增加加酶量，制備的風味大豆肽的感官評分基本趨于平穩，不再增加。這是因為加酶量不足時，在一定時間內大豆分離蛋白的復合酶解作用不完全，此時，增加復合酶的加酶量，能提高酶解速率和最終酶解液中氨基酸和多肽的含量，從而使得制備的風味大豆肽的感官評分提高。當加酶量充足時，再增加復合酶的加酶量，僅僅會提高酶解初期的水解速率，無法改變最終的酶解產物，在此情況下繼續提高加酶量，對最終制備的風味大豆肽的感官評分幾乎沒有貢獻。因此，選擇2000 U/g作為單因素實驗的最適加酶量。

2.5 響應面法優化復合酶解的工藝條件

本文在單因素實驗的基礎上，固定酶解時間2.5 h，選取對酶解影響相對較大的3個因素酶解溫度、pH、加酶量，根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，分別以 A，B，C表示，進行3因素3水平的響應面優化試驗，試驗因素和水平設計見表4[12]。

表4 響應面分析法因素與水平表Table 4 Factors and levels of response surface method

響應面試驗分析結果見表5，利用Design Expert 軟件對表5 試驗結果進行回歸擬合分析，感官評分Y 對酶解溫度(A)、pH(B)、加酶量(C)的二次多項回歸方程為：Y=78.02-0.05A+0.42B+0.1C+0.001AB+0.001AC+0.033BC-0.31A2+0.12B2-0.079C2。

表5 響應面分析結果Table 5 The results of response surface analysis

回歸方程方差分析見表6。

表6 方差分析表Table 6 The table of variance analysis

續 表

注：“*”表示差異不顯著，P>0.05； “**”表示差異顯著，P<0.05；“***”表示差異極顯著，P<0.01。

由表6可知，模型極顯著(P<0.01)，一次項酶解溫度(A)、pH(B)、加酶量(C)極顯著；二次項A2，B2，C2極顯著；交互項AB，AC不顯著，BC極顯著；模擬方程極顯著，失擬項不顯著(P=0.1489)。

表7 回歸方程可信度分析Table 7 The credibility analysis of regression equation

由表7可知，建立的模型具有較高的總決定系數(R2=0.9991)，同時CV值較低，具有較好的試驗穩定性，說明該試驗所得到的二次方程能夠很好地對試驗結果進行預測。由回歸方程所做的響應曲面圖及其等高線圖見圖8～圖10。

圖8 酶解溫度和pH對感官評分的影響Fig.8 Effects of enzymolysis temperature and pH on sensory score

圖9 酶解溫度和加酶量對感官評分的影響Fig.9 Effects of enzymolysis temperature and enzyme dosage on sensory score

圖10 pH和加酶量對感官評分的影響Fig.10 Effects of pH and enzyme dosage on sensory score

由圖8～圖10可知酶解溫度、pH、加酶量對制備后風味大豆肽風味感官評分的影響。由圖8～圖10可知，pH對風味大豆肽風味感官評分的影響非常顯著，表現為曲線較陡，等高線隨其數值變化而迅速變化；加酶量和酶解溫度次之，表現為曲線較平緩，等高線隨其數值變化較小。回歸模型預測感官評分最高的風味大豆肽制備的最佳酶解工藝條件為酶解溫度49.97 ℃，pH 7.49，加酶量2167 U/g，此時的感官評分為5.45。

2.6 實驗性驗證

為驗證該響應面優化方法的真實性，采用上述響應面優化的最佳酶解條件對大豆分離蛋白進行酶解，為貼合實際，制定條件為酶解溫度50 ℃，pH 7.5，加酶量2167 U/g，重復酶解3次，酶解產物經美拉德反應制備風味大豆肽，其感官評分的平均值為5.38，與預測值的相對誤差僅為1.28%，因此采用響應面優化的工藝條件參數準確可靠，具有實用價值。

3 結論

為探究最佳風味大豆肽的制備工藝，本文以大豆分離蛋白為原料，綜合考慮水解度和感官評分，確定了風味蛋白酶和堿性蛋白酶以0.8∶1.0進行復配作為酶解用酶，并采用響應面法對酶解條件進行優化，最終得出最佳酶解工藝為：風味蛋白酶和堿性蛋白酶復配比例0.8∶1.0，酶解時間2.5 h，酶解溫度50 ℃，pH 7.5，加酶量2167 U/g。在該條件下制備的風味大豆肽的感官評分最高，為5.38。

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