醬鹵制品常用香辛料主效成分檢測方法初步研究

艾有偉，侯溫甫，張潔，王宏勛

(武漢輕工大學，武漢 430023)

醬鹵肉制品是將鮮(凍)畜禽肉及可食副產品置于添加有食鹽、醬油(或不加)、香辛料的水中[1]，經預煮、燒煮、醬制(鹵制)等工序加工而成[2]，集肉香、醬香于一體的休閑食品[3]。風味獨特，品種繁多，距今有多年歷史[4]，具有巨大市場潛力[5]。以醬鹵鴨制品系列為代表的湖北肉鴨熟食產品，已成為湖北地方特色食品，深受國內外消費者喜愛。

香辛料是醬鹵鴨制品加工過程中的重要原料，其含有的主效成分是形成醬鹵鴨制品獨特風味的重要成分基礎。現階段醬鹵制品加工工藝中香辛料多采用直接添加的方法，但受限于香辛料的品種、產地、收獲期、生產年份等差異，使得各香辛料中的主效成分存在一定的差異[6]，而直接影響到不同批次產品間的風味穩定性，一定程度影響消費者對產品的感官體驗。本文以醬鹵制品常用香辛料為研究對象，建立各主效成分含量的測定方法。旨在建立香辛料主效成分標準化檢測方法，為明晰不同批次、產地、品種中香辛料主效成分含量之間的差異提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：辣椒、花椒、八角、桂皮、陳皮、白芷、砂姜、丁香、紫蘇、黑胡椒、小茴香、肉豆蔻、當歸、香葉、草果，購于武漢舵落口香料批發市場。

標準品：辣椒素標準品、二氫辣椒素標準品、β-山椒素標準品、莽草酸標準品、桂皮醛標準品、橙皮苷標準品、歐前胡素標準品、山奈酚標準品、丁香酚標準品、紫蘇醛標準品、胡椒堿標準品、反式茴香腦、桉油精、阿魏酸(純度95%)，購于成都克洛瑪生物公司。

試劑：甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、磷酸(優級純)、甲酸(色譜純)、乙酸(色譜純)，國藥集團化學試劑有限公司；95%食用酒精；正己烷(色譜純)，德國Meker公司。

1.2 儀器與設備

Aglilent 1260LC高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司；超純水系統 Milli-Q Integral公司；SB-5200DTN超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；GZX-9140MBE數顯鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司；RE-2000A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠； YB-1000A型高速多功能粉碎機 浙江省永康市速峰工貿有限公司；CP214電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；TGL-16G離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 各香辛料中主效成分及其主效成分高效液相色譜檢測條件

15種香辛料中花椒、桂皮、陳皮、白芷、砂姜、紫蘇、黑胡椒、小茴香、八角、當歸10種香辛料對應主效成分分別為β-山椒素、桂皮醛、陳皮苷、歐前胡素、山奈酚、紫蘇醛、胡椒堿、反式茴香腦、莽草酸、阿魏酸；辣椒中主效成分為辣椒素和二氫辣椒素；香葉、草果2種香辛料主效成分均為桉油精；丁香、肉豆蔻2種香辛料對應主效成分均為丁香酚，故15種香辛料對應主效成分共14種。

1.3.1.1 辣椒素和二氫辣椒素2種成分色譜檢測條件[7]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為280 nm;采用A和B雙泵系統，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為甲醇，流動相B為水(65∶35,V/V)。

1.3.1.2 桂皮醛色譜檢測條件[8]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為25 ℃，檢測波長為290 nm;采用A和B雙泵系統，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為水(32∶68,V/V)。

1.3.1.3 陳皮苷色譜檢測條件[9]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為283 nm;采用A和B雙泵系統，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為水(pH 3,23∶77,V/V)。

1.3.1.4 胡椒堿色譜檢測條件[10]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為343 nm;采用A和B雙泵系統，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為水(40∶60,V/V)。

1.3.1.5 丁香酚色譜檢測條件[11]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為270 nm;采用A和B雙泵系統，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為甲醇，流動相B為0.2%磷酸溶液(70∶30,V/V)。

1.3.1.6 β-山椒素色譜檢測條件[12]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為254 nm;采用A和B雙泵系統，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液(45∶55,V/V)。

1.3.1.7 山奈酚色譜檢測條件[13]

1.3.1.8 歐前胡素色譜檢測條件[14]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為247 nm;采用A和B雙泵系統，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為水(65∶35,V/V)。

1.3.1.9 紫蘇醛色譜檢測條件[15]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為230 nm;采用A和B雙泵系統，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為水(75∶25,V/V)。

1.3.1.10 反式茴香腦色譜檢測條件[16]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為254 nm;采用A和B雙泵系統，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為甲醇，流動相B為水(80∶20,V/V)。

1.3.1.11 莽草酸色譜檢測條件[17]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為210 nm;采用A和B雙泵系統，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為0.5%磷酸水溶液(體積比95∶5,V/V)。

橡膠圈外觀質量應符合以下要求：顏色均勻，表面不應有游離硫；材質致密，無肉眼可見的雜質、氣孔、裂縫及其他有礙使用的缺陷；單個橡膠圈上凹凸不超過1 mm，面積不超過6 mm2，且不多于3處；飛邊須除凈，其厚度不應超過0.4 mm，剪損寬度應不超過0.8 mm；無平面扭曲現象，帶接頭的橡膠圈，接頭處應平順無分離跡象，接頭處錯位不應超過0.5 mm；每個橡膠圈只容許有1個接頭。

1.3.1.12 桉油精色譜檢測條件[18]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為40 ℃，檢測波長為203 nm;采用A和B雙泵系統，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為水(70∶30,V/V)。

1.3.1.13 阿魏酸色譜檢測條件[19]

色譜柱Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為40 ℃，檢測波長為323 nm;采用A和B雙泵系統，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為乙酸溶液(pH 3,15∶85,V/V)。

1.3.2 香辛料提取液制備

將15種香辛料樣品分別于65 ℃干燥4 h，經粉碎過60目篩。精確稱取香辛料樣品各5.00 g，加入60%食用酒精100 mL，于60 ℃下超聲提取2 h。靜置10 min后過濾濃縮定容至50 mL，經0.45 μm有機濾膜過濾后進行色譜分析。

1.3.3 香辛料主效成分標準品溶液制備方法

分別精確稱取1.3.1中14種香辛料主效成分標準品用其相對應流動相超聲溶解后配制成14種標準品溶液，經0.45 μm有機濾膜過濾后進行色譜分析。

1.3.4 傳統鹵水檢測前處理方法

取100 g傳統鹵水樣品加熱融化并除去表面油脂，逐個分裝至2.5 mL離心管中于12000 r/min轉速下離心5 min去除鹵水中的殘渣并取上清液，經0.45 μm濾膜過濾后進行色譜分析。

2 結果與分析

2.1 14種主效成分標準品檢測結果

精密吸取辣椒素標準品、二氫辣椒素標準品、β-山椒素標準品、桂皮醛標準品、橙皮苷標準品、歐前胡素標準品、山奈酚標準品、丁香酚標準品、紫蘇醛標準品、胡椒堿標準品、反式茴香腦標準品、莽草酸標準品、桉油精標準品、阿魏酸標準品14種香辛料主效成分的標準品溶液，每種標準品溶液進樣20 μL，按1.3.1的色譜條件測定，得到標準品高效液相測定色譜圖，見圖1。

圖1 14種主效成分標準品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 14 main effective components

注：各圖分別為辣椒素與二氫辣椒素(a)、桂皮醛(b)、橙皮苷(c)、胡椒堿(d)、丁香酚(e)、β-山椒素(f)、山奈酚(g)、歐前胡素(h)、反式茴香腦(i)、莽草酸(j)、桉油精(k)、阿魏酸(l)、紫蘇醛(m)。

由圖1可知，各香辛料主效成分辣椒素、二氫辣椒素、桂皮醛、橙皮苷、胡椒堿、丁香酚、β-山椒素、山奈酚、歐前胡素、反式茴香腦、莽草酸、桉油精、阿魏酸、紫蘇醛標準品的保留時間分別為12.875，19.597，16.327，6.038，21.092，5.036，10.086，15.134，6.141，7.542，3.425，5.132，4.823，7.560 min，且各標準品色譜峰峰形較好。

2.2 15種香辛料提取液中主效成分檢測方法研究

分別精密吸取15種香辛料提取液各20 μL，按1.3.1的色譜條件測定，經測定除八角提取液中莽草酸、香葉和草果提取液中桉油精、當歸提取液中阿魏酸這4種香辛料提取液中3種主效成分，由于提取液中其他成分干擾分離效果較差外，其余11種香辛料提取液中的11種有效成分目標峰與其他組分峰能夠良好地分離，其主效成分色譜圖見圖2。

圖2 11種香辛料提取液高效液相色譜色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 11 spices extracting solution

注：各圖分別為辣椒提取液(a)、桂皮提取液(b)、陳皮提取液(c)、胡椒提取液(d)、丁香提取液(e)、花椒提取液(f)、砂姜提取液(g)、白芷提取液(h)、小茴香提取液(i)、紫蘇提取液(j)、肉豆蔻提取液(k)。

由圖2可知，11種香辛料提取液中的11種主效成分的保留時間分別為：(1)辣椒提取液中辣椒素和二氫辣椒素的保留時間分別是12.679，19.330 min；(2)桂皮提取液中桂皮醛的保留時間是16.338 min；(3)黑胡椒提取液中胡椒堿的保留時間是20.946 min；(4)陳皮提取液中橙皮苷的保留時間是6.045 min；(5)丁香提取液中丁香酚的保留時間是5.008 min；(6)花椒提取液中β-山椒素的保留時間是10.156 min；(7)砂姜提取液中山奈酚的保留時間是15.156 min；(8)白芷提取液中歐前胡素的保留時間是6.158 min；(9)紫蘇提取液中紫蘇醛的保留時間是7.522 min；(10)小茴香提取液中反式茴香腦的保留時間是7.510 min；(11)肉豆蔻提取液中丁香酚的保留時間是5.034 min。上述主效成分保留時間均與圖1對應標準品保留時間一致，且分離效果良好。

2.3 標準曲線繪制及香辛料提取液中主效成分含量檢測

2.3.1 標準曲線的繪制

依據辣椒、花椒、桂皮、陳皮、白芷、砂姜、丁香、紫蘇、黑胡椒、小茴香、肉豆蔻11種香辛料中主效成分檢測方法，精確吸取辣椒素、二氫辣椒素、β-山椒素、桂皮醛、橙皮苷、歐前胡素、山奈酚、丁香酚、紫蘇醛、胡椒堿和反式茴香腦不同濃度梯度的標準品溶液，分別進樣20 μL。按照1.3.1的液相條件進行檢測，以標準品濃度作為橫坐標，峰面積作為縱坐標，分別得到辣椒素、二氫辣椒素、β-山椒素、桂皮醛、橙皮苷、歐前胡素、山奈酚、丁香酚、紫蘇醛、胡椒堿和反式茴香腦11種香辛料主效物質的標準曲線、回歸方程、相關系數、濃度范圍，見表1。

表1 11種常見香辛料中主效成分的線性方程、相關系數及檢測濃度范圍Table 1 Linear equations,correlation coefficients and concentration ranges of main effective components in 11 common spices

2.3.2 香辛料提取液中主效成分含量測定

取同一批次的香辛料干粉，按照1.3.2中樣品溶液的提取方法進行制備，過0.45 μm有機濾膜進行色譜分析重復進樣3次，做3個平行。取峰面積代入曲線方程，得到每種香辛料提取液的主效成分含量,見表2。

表2 11種常見香辛料提取液中主效成分含量Table 2 The main effective components in 11 common spices extracting solution

2.4 傳統鹵水中香辛料主效成分檢測結果

按照1.3.4方法處理傳統鹵水，采用1.3.1中方法對傳統鹵水中香辛料主效成分進行色譜分析。經測定得到辣椒素、胡椒堿、β-山椒素、橙皮苷4種主效成分的含量分別為0.060，0.056，0.072，0.037 mg/mL。

3 結論

采用高效液相色譜法建立了14種香辛料主效成分標準品的測定方法，經測定，辣椒素、二氫辣椒素、桂皮醛、胡椒堿、橙皮苷、山奈酚、歐前胡素、丁香酚、β-山椒素、紫蘇醛、反式茴香腦11種香辛料提取液主效成分在高效液相條件下分離效果較好。最終確定11種常見香辛料提取液中主效成分含量及傳統鹵水中4種香辛料主效成分含量。本文通過11種常見香辛料提取液中主效成分測定方法的建立，為香辛料及醬鹵制品中香辛料主效成分標準化方法檢測提供了技術支撐。

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