固相萃取-超高效液相色譜質譜法測定液體乳中愛德萬甜

公丕學，楊昊，廉貞霞，薛霞，劉桂亮，王駿，劉艷明*

(1.山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101；2.山東省藥學科學院，濟南 250101)

愛德萬甜(Advantame)，分子式為N-(N-(3-(3-羥基-4-甲氧基苯基)丙基-L-a-天冬氨酰)-L-苯丙氨酸-1-甲酯)(C24H30N2O7·H2O)，分子量為476.52，是阿斯巴甜的衍生產品，其化學結構與紐甜類似，見圖1，是一種非營養、低熱量、高強度的新型甜味劑，用量可以遠低于現有市場上的蔗糖和其他甜味劑，能添加于多種食品中，甜味可達蔗糖的20000倍。2014年5月21日，美國FDA發布最終法規，修訂食品添加劑條例，批準高倍甜味劑Advantame作為非營養甜味劑和增味劑用于除肉類及家禽之外的食品中[1]。日本厚生勞動省、FSANZ、美國FDA等允許愛德萬甜作為甜味劑使用，根據FAO/WMO食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)的評估結果，愛德萬甜每日最大允許攝入量不超過5 mg/kg·bw[2,3]。

圖1 愛德萬甜分子結構圖Fig.1 Molecular structure of advantame

目前，在國外愛德萬甜作為一種新型超級甜味劑被廣泛應用于食品、飲料和藥品中,其安全性得到了國外食品安全機構的認可。國家衛計委在2017年10月31日發布《關于愛德萬甜等6種食品添加劑新品種、環己基氨基磺酸鈉(又名甜蜜素)等6種食品添加劑擴大用量和使用范圍的公告(2017年第8號)》[4]，該物質可作為甜味劑用于多種食品類別，改善食品口感。國內僅有檢測飲料中愛德萬甜的液相色譜方法報道[5]，分離時間為15 min，線性范圍為0.05～5.0 mg/L。在測定復雜基質時，液相色譜法存在干擾，降低方法的靈敏度，影響定量結果的準確性。國內還沒有愛德萬甜的液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)檢測方法，超高效液相色譜(UPLC)比高效液相色譜(HPLC)分析速度更快，分離能力更好，LC-MS/MS法將LC對復雜基質樣品的分離優勢，與串聯質譜的高靈敏度、高選擇性等優點結合起來，目前已經被廣泛應用于食品分析檢測[6-9]。液體乳基質復雜，在檢測中能夠顯著影響目標離子生成效率及離子強度，從而影響檢測結果的準確度和靈敏度。因此前處理過程中應除去干擾成分，常用的前處理方式有直接提取[10,11]、液液萃取[12]、SPE[13]、沉淀蛋白[14]、QuECHERS等方法[15-18]。

本研究結合SPE技術，采用UPLC串聯MS技術檢測液體乳中的愛德萬甜，10 min 內即可完成目標物的分析檢測，線性范圍寬，檢出限低，對食品中愛德萬甜的檢測有更廣闊的應用前景。去除食品中基質干擾，提高分析靈敏度，建立了檢測液體乳中愛德萬甜的UPLC電噴霧串聯三重四級桿質譜聯用的分析方法，填補了國內檢測愛德萬甜質譜定性定量法的空白，對國內愛德萬甜的探索研究具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

熱電TSQ Quantiva三重四級桿質譜儀配備ESI電離源，熱電U-3000液相色譜儀 美國賽默飛世爾公司；BSA822-cw型電子天平 德國賽多利斯公司；AB204-S型電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；MS-3基本型旋渦混合器 德國艾卡公司；超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；高速冷凍離心機 德國西格瑪公司；Milli-Q超純水機 美國密理博公司；控溫氮吹儀 美國Organomation公司；HLB SPE柱(3 mL/60 mg) 美國Waters公司。

色譜柱：Accucore C18(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)，色譜純乙腈，色譜純甲醇：購于美國Thermo Fisher公司；色譜純醋酸銨：購于德國Flukar公司；分析純氨水，分析純亞鐵氰化鉀，分析純乙酸鋅：購于國藥集團化學試劑(北京)有限公司；愛德萬甜標樣(純度≥97.0%)：購于美國Sigma-Aldrich公司；0.22 μm孔徑有機濾膜：購于上海安譜實驗科技股份有限公司。

愛德萬甜標準儲備液的配制: 準確稱取愛德萬甜標準品 10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，配成1.00 mg/mL 的儲備液，放置于4 ℃冰箱保存。

1.2 樣品預處理

1.2.1 樣品提取

稱取2 g(精確到0.01 g)液體乳樣品到50 mL離心管中，加10 mL水渦旋分散混勻，分別準確加入沉淀劑0.3 mL亞鐵氰化鉀溶液(質量濃度為106 g/L)、0.3 mL乙酸鋅溶液(質量濃度為183 g/L)渦旋分散混合均勻，超聲波清洗器中超聲提取30 min后，用水定容至15 mL，在離心機中以8000 r/min高轉速下離心5 min，過濾取清液待凈化。

1.2.2 樣品凈化

用3 mL甲醇、3 mL水活化HLB SPE 柱，將提取清液以1滴/s的速度上樣，5 mL 5%甲醇淋洗，抽干，用5 mL甲醇分2次洗脫，然后用甲醇直接定容至5 mL，定溶液經有機濾膜過濾后待上機檢測。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件色譜柱

Accucore C18；流動相A：乙腈，流動相B：0.1%甲酸，液相色譜流動相梯度洗脫程序見表1；流動相流速：0.30 mL/min；柱溫箱溫度：40 ℃；進樣針進樣體積：5 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution program

1.3.2 質譜條件電離源離子化模式

電流方式ESI+；氣體流速： 40 units；輔助氣體流速：12 units；噴霧電壓：3500 V；離子傳輸管溫度：333 ℃；蒸發器溫度：317 ℃；碰撞氣體壓力(Ar)：2mTorr。愛德萬甜優化的關鍵質譜參數見表2。

表2 愛德萬甜優化的關鍵質譜參數Table 2 The optimized MS parameters of advantame

注：*為定量離子。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

流動相的酸堿性影響愛德萬甜離子化效率，同時會影響液相色譜峰峰形，本試驗比較了中性流動相A(乙腈-水)、堿性流動相B(乙腈-0.1%氨水，V/V)、酸性流動相C(乙腈-0.1%甲酸，V/V)3種不同酸度流動相體系。在相同液相色譜分離程序下，考察愛德萬甜色譜峰峰形以及響應情況，定量離子質譜圖見圖2。

圖2 愛德萬甜在不同酸度流動相的定量離子(459>192)質譜圖Fig.2 Mass spectrograms(459>192) of advantame in different mobile phases

注：A為中性流動相；B為堿性流動相；C為酸性流動相。

實驗結果表明：乙腈-0.1%甲酸流動相條件下的目標物峰形要優于另外兩種流動相的峰形，質譜信號響應值增強。實驗中采用正離子模式檢測，使用酸性流動相能夠提高愛德萬甜離子化效率，響應信號強度增強，靈敏度提高。使用堿性流動相抑制愛德萬甜離子化效率，信號強度降低了1/2，中性流動相中信號強度降低，峰形差，影響定性定量結果。因此，選取乙腈-0.1%甲酸作為流動相，色譜峰峰形好，靈敏度高。

2.2 質譜條件的優化

液相色譜串聯質譜中常用的電離方式有ESI和APCI，根據分子結構可以看出愛德萬甜屬于極性較強的化合物，APCI優勢在于檢測中等或者小極性的化合物，因此試驗中選擇ESI電離分析方式。

愛德萬甜分子結構中含有2個仲氨基團，容易結合氫，形成[M+H]+準分子離子峰，因此在質譜檢測中離子源電離模式選擇時，應該首先考慮使用ESI+模式。愛德萬甜分子量為476.52，去掉H2O后的分子量為458.504，根據形成[M+H]+準分子離子峰推算出母離子為459.504 m/z。將質量濃度為100 ng/mL的愛德萬甜標準溶液通過蠕動泵直接注入三重四級桿質譜儀，在ESI+模式下進行愛德萬甜母離子掃描，確定其準分子離子峰豐度最大條件，得到愛德萬甜的母離子為459 m/z；調節質譜關鍵參數后進行愛德萬甜的子離子掃描，然后進一步優化碰撞電壓等質譜參數，選擇2個豐度較高的子離子，以豐度相對高的子離子459>192作為定量離子，以豐度相對較低的子離子459>102作為輔助定性離子。愛德萬甜標準溶液的MRM見圖3。

圖3 愛德萬甜標準溶液的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of advantame standard solution

注：A為定量離子459>192；B為定性離子459>102。

2.3 沉淀劑使用量的影響

液體乳中含有蛋白質、脂肪、磷脂等，在分析檢測過程中，基質成分與待測物在霧滴表面離子化競爭過程中能夠顯著增強或降低目標離子生成效率及離子強度，從而對檢測結果會產生嚴重影響，因此在前處理過程中需加入沉淀劑去除雜質組分的干擾。沉淀劑的使用量影響沉淀效果和過濾時間,因此考察了沉淀劑的加入體積為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL時與過濾時間的對應關系，見圖4中A。不加入沉淀劑時，過濾時間較長，當沉淀劑用量大于0.3 mL時，過濾時間小于12 min并趨于穩定。考察了沉淀劑加入體積為0.3，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0 mL對峰面積響應值的影響，見圖4中B。

圖4 沉淀劑使用量的影響Fig.4 The influence of precipitant

注：A為沉淀劑使用量與過濾時間的關系；B為沉淀劑使用量與峰面積的關系。

當沉淀劑大于0.3 mL時峰面積響應值逐漸降低，靈敏度降低，綜合考慮，選擇沉淀劑體積為0.3 mL時，既可以提高工作效率，又可以保證檢測靈敏度。

2.4 SPE柱的選擇

SPE柱的使用能夠進一步提高雜質去除效果和靈敏度。在實驗中考察了C18柱、WAX柱、HLB柱、 SAX柱和 MAX柱5種SPE柱對液體乳中愛德萬甜的凈化效果，見圖5。

圖5 愛德萬甜通過不同SPE柱的回收率Fig.5 The recoveries of advantame through different SPE columns

由圖5可知，使用HLB SPE柱時回收率最高，因此實驗中選用HLB SPE柱凈化樣品，提高檢測的靈敏度和準確度。

2.5 方法的線性范圍和檢出限

將基質加標標準工作溶液按濃度從低到高依次經超高效液相色譜-串聯質譜法測定，以愛德萬甜標準工作溶液的質量濃度(ng/mL)為橫坐標，以其豐度較高的定量離子對響應峰面積為縱坐標，繪制愛德萬甜標準工作曲線，在1～1000 ng/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=8001x-9.554，線性相關系數為0.9992。以信號與噪音比值S/N≥3作為檢出限(LOD)計算結果為2 μg/kg。空白樣品色譜圖見圖6，樣品加標色譜圖見圖7。

圖6 空白樣品質量色譜圖Fig.6 MRM chromatograms of blank samples

注：A為定量離子459>192；B為定性離子459>102。

圖7 加標樣品質量色譜圖Fig.7 MRM chromatograms of spiked samples

注：A為定量離子459>192；B為定性離子459>102。

2.6 方法的回收率和精密度

采用不同類型液體乳(滅菌乳、調制乳和發酵乳)空白樣品，進行添加回收率和精密度的實驗。空白樣品中分別添加50，100，500 μg/kg 3個濃度水平，按照本方法進行處理，每個添加水平進行平行測定6次。同時使用基質匹配標準溶液進行回收率和偏差計算，結果見表3。

表3 添加回收率與精密度(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs for the determination of advantame(n=6)

由表3可知，愛德萬甜的回收率在90%～116%。不同水平加標樣品重復測定6次，測定結果表明RSD為0.21%～1.59%。結果表明該方法能夠滿足實際樣品的檢測需要。

3 結論

通過優化實驗條件，選擇沉淀劑(亞鐵氰化鉀和乙酸鋅)分別為0.3 mL，HLB SPE柱，能夠提高方法的準確性及靈敏度，選擇能夠增強離子化效率的酸性流動相(乙腈-0.1%甲酸)，建立了SPE-超高效液相色譜電噴霧串聯三重四級桿質譜聯用檢測液體乳中愛德萬甜的分析方法。

本方法具有線性范圍寬、檢出限低、效率高、靈敏度高、定性、定量準確等優點，適用于不同類型液體乳中愛德萬甜的定性確證與定量檢測，填補了國內超高效液相色譜串聯質譜法測定愛德萬甜的空白，可以為政府監管提供技術支持，為制定食品安全標準提供理論依據。

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