慢病毒介導CDCA5敲低的三陰乳腺癌細胞的構建及鑒定

呂璐冶，黃燕，李萬金，韓秋影,宋楠，張學敏，周濤

國家生物醫學分析中心，北京 100850

乳腺癌是一類發生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤[1]，其發病率位居女性腫瘤第一位，約占女性新發腫瘤的30%，致死人數占女性腫瘤死亡總人數的14%[2-4]。其中三陰乳腺癌（triple-negativebreast cancer）患者約占乳腺癌患者總體病例的20%，其特點是腫瘤細胞缺乏雌激素受體（estrogenreceptor，ER）、孕激素受體（progesteronereceptor，PR）和人表皮生長因子受體2（humanepidermalgrowthfactor receptor2，HER2）的表達[5-7]。與非三陰乳腺癌相比，三陰乳腺癌往往具有較快的腫瘤進程和較強的侵襲性，并且對化療響應差。患者發病5年內具有較高的復發率及死亡率[8-10]。目前臨床使用的主要治療手段如手術、放化療、免疫治療、內分泌治療等，對三陰乳腺癌治療效果有限，因而尋找新的三陰乳腺癌治療靶點具有重要意義[9,11]。

細胞分裂周期相關蛋白5（celldivisioncy?cleassociated5，CDCA5）是細胞周期有絲分裂檢查點重要復合物——Cdh1激活的后期促進復合物（anaphase-promotingcomplex，APC）的底物，參與調節姐妹染色單體與黏連蛋白的結合[12-14]。CDCA5在脊椎動物中廣泛表達，保守性強，且在其他種類生物如酵母、爪蛙卵中存在同源基因，同樣參與調節黏連蛋白與染色體之間的相互作用[13]。有研究指出，敲除CDCA5顯著影響G2期細胞維持黏連蛋白與DNA穩定結合[15]。近年研究發現CDCA5在多種亞型肺癌中高表達，超過70%的非小細胞肺癌呈CDCA5陽性，并且指示不良預后[16]。但是CDCA5作為癌基因，在乳腺癌及其他腫瘤中是否發揮作用有待研究。

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術是一種能夠特異性敲低或沉默體內目的基因表達的分子生物學技術[17-18]，具有高效、穩定、特異性強、可遺傳等優點，是生物學研究的重要工具[19-21]。慢病毒載體是一種基于逆轉錄病毒發展出的基因載體，能夠高效地將外源基因整合進宿主細胞，并持續穩定表達。慢病毒載體的應用克服了瞬轉過程中轉染效率差、干擾RNA表達時間短等問題，目前在生物學研究中已得到廣泛應用。

本實驗室前期研究表明CDCA5蛋白在三陰乳腺癌患者癌組織中高表達，且與患者不良預后存在正相關，指示CDCA5在三陰乳腺癌中可能存在重要功能。為深入探討CDCA5在三陰乳腺癌增殖、轉移中的作用及相關分子機制，我們應用慢病毒感染體系和RNAi技術，構建了穩定干涉CDCA5表達的三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231，為進一步研究提供重要的實驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料

MDA-MB-231細胞、用于病毒包裝的HEK293細胞來源于本實驗室細胞庫；大腸桿菌DH5α感受態細胞購自Genstar科技有限公司；pLKO.1空載體質粒（嘌呤霉素抗性）、對照組質粒來源于本實驗室質粒庫。

限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶購自Ther?moFisherScientific有限公司；核酸膠回收試劑盒、小提質粒提取試劑盒均購自Promega公司；Opti-MEM、DMEM培養基、RPMI1640培養基、磷酸鈣轉染試劑、抗生素（青霉素、鏈霉素）、胰蛋白酶均購自邁晨科技有限公司；胎牛血清購自Hy?clone公司；2×上樣緩沖液購自北京鼎國科技有限公司；蛋白質轉印PVDF膜購自GEHealthcare公司；免疫印跡用兔抗人CDCA5抗體購自SigmaAl?drich公司；鼠抗人Tubulin抗體購自CellSignal?lingTechnology公司；辣根過氧化物酶標記的兔抗人二抗購自Jakson公司；ECL顯影試劑購自威哥拉斯公司；CellTiter96AqueousOneSolution CellProliferationAssay購自Promega公司。

細菌培養箱購自上海一恒科技有限公司；PCR儀購自Biometra公司；恒溫金屬浴購自杭州恩盛公司；恒溫搖床購自上海恒智公司；細胞孵箱購自SANYO公司；藍光切膠儀購自無錫博弗瑞德公司；核酸電泳儀購自Bio-Rad公司；熒光儀購自TECAN公司；常溫高速離心機購自Sigma公司；低溫高速離心機購自Eppendorf公司；細胞操作臺購自Airtech公司。

1.2CDCA5短發夾RNA（shRNA）引物設計

在 PublicTRCPortal（https://portals.broadinsti?tute.org/gpp/public/）和 Sigma網站（https://www.sig?maaldrich.com/）在線設計人源CDCA5特異shRNA干涉序列，選擇其中2條得分較高且適用于pLKO.1載體構建的序列（表1、2）。

1.3CDCA5shRNA慢病毒質粒的構建與鑒定

①將合成的CDCA5shRNA單鏈引物稀釋至10μmol/L，取互補的單鏈引物（1#F和1#R，或2#F和2#R）對應等量混勻；②取混合液5μL，加入5μL10×退火緩沖液、40μLddH2O配制成引物退火體系，置95℃水浴鍋中加熱15min，停止加熱4h后體系溫度達到室溫，完成退火；③取pLKO.1空載體質粒5μg，加入10×緩沖液、限制性內切酶EcoRⅠ和AgeⅠ各5μL，用ddH2O補齊至50μL酶切體系，于37℃水浴鍋中酶切1h；④將酶切產物加入1.5%瓊脂糖核酸膠中，130V恒壓進行凝膠電泳，根據酶切位點確定目的片段大小并切下目的條帶，用膠回收試劑盒回收載體酶切DNA片段；⑤各取回收的pLKO.1酶切片段和shRNA引物1μL退火，加入T4DNA連接酶和緩沖液各1μL，與6μLddH2O混合均勻，室溫連接2h；⑥將30μL大腸桿菌DH5α感受態細胞置于冰上，加入5μL連接產物混勻，配制成轉化體系，30min后在42℃水浴鍋熱激90s，迅速冰浴10min；⑦向轉化體系中加入無抗LB液體培養基500 μL，37℃搖床孵育1h，3000r/min常溫離心3min后棄300μL上清，重懸菌液，均勻涂布于LB固體培養基（含氨芐青霉素），37℃細菌孵箱中過夜；⑧用限制性內切酶EcoRⅠ和AgeⅠ對LB固體培養基中的單克隆進行雙酶切，產物通過核酸膠電泳鑒定；⑨選取有明顯條帶的陽性單克隆菌落分別加入5mLLB液體培養基（含氨芐青霉素）進行培養，用試劑盒提取質粒并測序。

表1 CDCA5干涉靶序列

表2CDCA5shRNA引物序列

1.4 病毒包裝、感染

在10cm培養皿內接種1×106HEK293細胞，待細胞貼壁，細胞密度達到50%左右時進行病毒包裝：①將 VSVG（1.5 μg）、PAX2（4.5 μg）、對照組質粒或CDCA5干涉質粒（6μg）加入1mL HBS中，輕柔混勻，室溫靜置5min；②向該混合液中緩慢加入67μLCaCl2，混勻后室溫靜置15 min；③將混合液逐滴均勻加入HEK293細胞中，轉染10h后更換為10mLDMEM完全培養基；④分別于轉染后48和72h收集病毒，48h第一次收集培養上清并補加新鮮培養基，室溫1500r/min離心5min，取上清在50mL離心管中于4℃保存，72h第二次收集病毒；⑤將2次收集的上清液混勻，1500r/min離心5min；⑥取培養基上清加入病毒濃縮柱中，6000r/min低溫離心30 min，收集濾芯中含病毒培養基，-80℃儲存；⑦將2×106MDA-MB-231細胞接種于10cm培養皿，待完全貼壁后更換為10mL含8μL促感染劑聚凝胺（Polybrane）的RPMI1640完全培養基；⑧向MDA-MB-231細胞中均勻滴加濃縮后病毒，恒溫細胞孵箱培養24h；⑨撤去含病毒培養基，更換為含嘌呤霉素（2μg/mL）的RPMI1640完全培養基繼續培養，直至細胞無大面積死亡，完成篩選。

1.5 細胞感染后的干涉效果和增殖能力檢測

將用嘌呤毒素篩選過的表達穩定干涉質粒的MDA-MB-231細胞培養皿置于冰上，棄掉培養基，用PBS清洗2次，用細胞裂解液（20mmol/L pH7.4Tris-HCl，3mmol/LEDTA，3mmol/LEG?TA，0.5%NP40，250mmol/LNaCl，50×Cocktail）裂解10min，收集裂解產物，12000r/min低溫離心3min，收集上清加入等量2×上樣緩沖液混勻，105℃金屬浴加熱30min，使樣品蛋白質充分變性，用Western印跡檢測CDCA5蛋白的表達水平。

將篩選后的MDA-MB-231細胞進行消化處理，將對照組和干涉組細胞用臺盼藍進行活細胞計數，種入7個96孔板中，每孔接種2×103細胞，每種細胞種3個復孔，分別于接種培養的第0、24、48、72、96、120、144h檢測每孔細胞活力。

2 結果

2.1 pLKO.1-CDCA5-shRNA質粒構建

利用數據庫信息設計了特異針對人源CDCA5進行干涉的引物序列。將退火引物加入DNA核酸膠中進行電泳，發現核酸凝膠最前端出現明顯條帶（圖1），表明引物退火成功。根據需求選取EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位點對pLKO.1空載體進行雙酶切。將載體片段與退火產物進行連接，構建pLKO.1-CDCA5-shRNA質粒。

2.2 菌液鑒定與質粒測序

將2種CDCA5干涉質粒進行轉化后，分別挑選2株單克隆進行菌落酶切鑒定。PCR產物DNA凝膠電泳結果如圖2，核酸膠中1#、2#干涉質粒菌落均有明顯條帶，表明pLKO.1-CDCA5-shRNA質粒構建成功。培養陽性菌落，提取質粒并測序，將測序結果與shCDCA5-mRNA進行堿基序列比對，發現特異性干涉CDCA5基因的DNA片段成功插入pLKO.1空載體（圖3），表明pLKO.1-CDCA5-shRNA質粒構建成功。

2.3 MDA-MB-231中敲低CDCA5的干涉效果檢測

將對照組質粒與干涉組質粒用磷酸鈣轉染法進行病毒包裝，收集48與72h含病毒培養基，用100k病毒濃縮柱濃縮病毒，感染人乳腺癌細胞系MDA-MB-231，24h后進行抗性篩選。收集篩選得到的穩定表達干涉質粒的細胞樣品，通過Western印跡檢測CDCA5蛋白質表達水平，結果見圖4，與對照組相比，表達1#、2#干涉質粒的細胞CDCA5蛋白表達水平顯著降低，2條干涉序列對CDCA5敲低效果明顯。

圖1CDCA5干涉序列引物退火結果

圖2 菌落酶切鑒定結果

圖3 pLKO.1-CDCA5-shRNA質粒測序

2.4 MDA-MB-231中敲低CDCA5后顯著抑制細胞增殖能力

細胞完成病毒感染、抗性篩選后，計數種入96孔板，用 CellTiter96AqueousOneSolution CellProliferationAssay分別檢測接種后第0、24、48、72、96、120、144h的細胞活力。結果顯示，敲低CDCA5能顯著抑制MDA-MB-231的細胞增殖能力（圖5）。

3 討論

乳腺癌是女性常見的癌癥和主要的癌癥致死原因[1-4]。隨著社會發展、人口老齡化、生化壓力增大及生態環境的惡化，乳腺癌發病率和復發率逐漸升高，并已成為威脅人類生存與社會發展的嚴重疾病和重大公共衛生問題[3]。而三陰乳腺癌因其惡性程度高、對化療的不敏感及缺乏ER、PR、HER2等常規靶點的表達，從發現以來便成為人們想要解決的重點問題[5-7,11]。因此，探索和發現三陰乳腺癌中新的基因靶點具有重大意義。

圖4CDCA5shRNA敲低CDCA5基因的效果檢測

CDCA5在人體多個組織器官中高表達，如骨髓、睪丸、胃、淋巴結、脾臟等，并且在一些癌細胞中也明顯高表達，如非小細胞肺癌、口腔鱗狀細胞癌、前列腺癌、胃癌等[16,22-24]。且文獻報道其與ERK通路、周期蛋白E1等具有相互作用，指示其在癌細胞增殖中發揮重要作用，但是CDCA5在三陰乳腺癌中的生理學功能還有待探索[16,23-24]。

前期，我們通過大數據分析發現CDCA5在三陰乳腺癌細胞中高表達。為了研究CDCA5在三陰乳腺癌中的調控功能，本實驗室利用RNAi技術和慢病毒感染體系，構建了穩定干涉CDCA5的MDA-MB-231細胞系。在隨后的細胞活力檢測實驗中，我們發現在干涉CDCA5后能夠顯著抑制三陰乳腺癌細胞的增殖能力，表明CDCA5在人三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖過程中發揮重要作用。那么CDCA5在三陰乳腺癌的發生、發展、轉移過程中是否具有調控作用，以及CDCA5對三陰乳腺癌患者抵抗放化療及復發具有怎樣的影響？本研究將為我們進一步探索CDCA5在三陰乳腺癌中的功能及相應機制提供實驗基礎。

圖5 敲低CDCA5抑制MDA-MB-231細胞增殖能力