5406放線菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗

李 麗 楊 倩 邢 力 秦秀麗

（吉林農(nóng)業(yè)科技學院 吉林市 132101）

5406放線菌又稱細黃放線菌（Actinomyces microflavus），在代謝過程中能夠產(chǎn)生次級代謝抗菌素、生長素以及細胞分裂素等生物活性物質(zhì)，能夠刺激種子生根、發(fā)芽，對土著性病原菌具有較好的抑菌作用，減少種子受病害侵害，使土壤中無效磷、鉀得到轉(zhuǎn)化[1-2]。因此能促進作物生長，防止作物及果蔬枯萎病、白粉病等多種病害的發(fā)生，提高作物及果蔬的品質(zhì)及產(chǎn)量[3-4]，是具有解鉀、解磷、抗病、促生、保苗等多功能的抗生菌肥[5-6]，在綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有較好的應用前景。目前培養(yǎng)5406放線菌試管菌種常用高氏1號培養(yǎng)基，由于長期使用該培養(yǎng)基以及對其生長的環(huán)境條件不甚了解，在5406放線菌培養(yǎng)過程中常發(fā)生菌絲生長慢、甚至停止生長，雜菌污染嚴重問題等，針對這些問題本試驗對培養(yǎng)5406放線菌常用的高氏1號加富培養(yǎng)基以及生長的環(huán)境條件進行研究，對高氏1號加富培養(yǎng)基配方及生長的環(huán)境條件進行了優(yōu)化，為5406放線菌菌種培養(yǎng)及菌肥的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種：5406放線菌試管菌種由吉林農(nóng)業(yè)科技學院生物工程學院微生物實驗室提供。

1.1.2 供試藥劑：葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、（NH4）2S04、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4、NaCL、瓊脂、NaOH、維生素 B1、維生素 B2、維生素 B6、維生素B12均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 菌種活化培養(yǎng)基：以高氏1號培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基及菌種活化培養(yǎng)基。其配方為可溶性淀粉20g、KNO33g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、NaCl 0.5g、瓊脂 18g、H2O 1000mL、pH為7.2。

1.1.3.2 供試培養(yǎng)基：以高氏1號培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別添加10g葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖等供試碳源至，配制供試高氏1號碳源加富培養(yǎng)基。

以高氏1號培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別添加10g酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、（NH4）2SO4等供試氮源，配制供試高氏1號氮源加富培養(yǎng)基。

維生素供試培養(yǎng)基：以高氏1號培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別添加0.2g維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12等供試維生素，配制供試高氏1號維生素加富培養(yǎng)基。

1.1.4 主要設備及用具

超凈工作臺（SW-CJ-2FD型，上海新苗醫(yī)療器械）；高壓蒸汽鍋（MLS-3781L-CP型，松下醫(yī)療器械）；生化培養(yǎng)箱（HPS-280型，哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司）；智能培養(yǎng)箱（PGX-350A型）；電子天平（BSA224S-CW型，賽多利斯科學儀器）；游標卡尺；分析天平；移液槍等。

1.2 方法

1.2.1 供試菌種的活化

配制高氏1號基礎試管培養(yǎng)基，在無菌條件下，用接種環(huán)從5406放線菌母種中挑取少許菌絲及孢子，試管培養(yǎng)基上劃線接種，27℃恒溫培養(yǎng)7天，選取菌落表面干燥、堅實多皺、菌絲潔白、致密的試管作為供試菌種，制備成104/mL孢子懸浮液。

1.2.2 高氏1號加富培養(yǎng)基（碳源、氮源、維生素）單因素試驗

在高氏1號基礎培養(yǎng)基按1.1.3.2分別加入供試碳源、氮源、維生素制備平板培養(yǎng)基，每個平板中接104/mL孢子懸浮液0.1mL，每個因素接20個平板，在27℃恒溫培養(yǎng)7天，觀測菌絲的長勢以菌落直徑[7]，確定高氏1號加富培養(yǎng)基中適宜的碳源、氮源、維生素。

1.2.3 高氏1號加富培養(yǎng)基最適配方的確定

根據(jù)1.2.2單因素試驗結(jié)果，以篩選出的適宜碳源、氮源、維生素、pH為試驗因素，設計L9（34）正交試驗[8]（設計見表1），配制9種高氏1號加富培養(yǎng)基，每個試驗組接20個平板。在27℃恒溫培養(yǎng)7天，觀測菌絲的長勢以菌落直徑，確定高氏1號加富培養(yǎng)基最佳組合。

表1 L9(34)營養(yǎng)液正交試驗因素及水平

1.2.4 5406放線菌生長環(huán)境條件的單因素試驗

1.2.4.1 5406放線菌生長適宜溫度的確定：按照優(yōu)化出的高氏1號加富培養(yǎng)基最適配方制作平板培養(yǎng)基，每個平板中接104/mL孢子懸浮液 0.1mL，分別放置于 25℃、30℃、35℃、40℃、45℃生化培養(yǎng)箱中在無光條件下培養(yǎng)7天，每個水平接20個平板，觀測菌絲的長勢以菌落直徑，確定5406放線菌生長的適宜的溫度條件。

1.2.4.2 5406放線菌生長適宜光照條件的確定：按照優(yōu)化出的高氏1號加富培養(yǎng)基最適配方制作平板培養(yǎng)基，每個平板中接104/mL 孢子懸浮液 0.1mL，分別放置于無光、100Lx、200Lx、300Lx、500Lx條件下，在最適溫度下進行培養(yǎng)7天。每個水平接20個平板，觀測菌絲的長勢以菌落直徑，確定5406放線菌生長的適宜的光照條件。

1.2.4.3 5406放線菌生長適宜空氣相對濕度的確定：按照優(yōu)化出的高氏1號加富培養(yǎng)基最適配方制作平板培養(yǎng)基，每個平板中接104/mL孢子懸浮液0.1mL，分別放置于空氣濕度為40%～50%、50%～60%、60%～70%、70%～80%條件下，在最適溫度和光照條件下進行培養(yǎng)7天。每個水平接20個平板，觀測菌絲的長勢以菌落直徑，確定5406放線菌生長的適宜的光照條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 高氏1號加富培養(yǎng)基（碳源、氮源、維生素）單因素試驗結(jié)果

2.1.1 高氏1號碳源加富培養(yǎng)基的篩選

圖1 5406放線菌在高氏1號不同碳源加富培養(yǎng)基上生長情況

試驗結(jié)果見圖1。試驗結(jié)果表明，在高氏1號基礎培養(yǎng)基中添加不同的供試碳源5406放線菌菌絲生長速度的影響是不同的。從圖1中可以看出5406放線菌在添加麥芽糖加富培養(yǎng)基上菌絲生長最快，接種7天后菌落直徑達到6.35mm，比對照培養(yǎng)基上菌落直徑大2.73mm，觀察菌落表面特征，菌絲呈白色，致密；其次是在蔗糖和葡萄糖加富培養(yǎng)基上生長較快，菌落直徑分別比對照培養(yǎng)基上菌落直徑大1.84mm和1.56mm，菌落表面白色，較致密；以乳糖為碳源加富培養(yǎng)基上菌落生長速度最慢，接種7天后菌落直徑達到4.54mm，比對照培養(yǎng)基上的菌落直徑大0.92mm，菌落表面白色，較致密。因此，通過試驗篩選出高氏1號碳源加富培養(yǎng)基為麥芽糖，其次為蔗糖和葡萄糖，生長最慢的為乳糖。

2.1.2 高氏1號氮源加富培養(yǎng)基的篩選

圖2 5406放線菌在高氏1號不同氮源加富培養(yǎng)基上生長情況

試驗結(jié)果見圖2。試驗結(jié)果表明，在高氏1號基礎培養(yǎng)基中添加不同供試氮源，對5406放線菌菌落生長速度的影響是不同的。從圖2中可以看出5406放線菌在添加牛肉膏氮源加富培養(yǎng)基上菌絲生長最快，接種7天后菌落直徑達到6.16mm，比對照培養(yǎng)基上菌落直徑大2.54mm，觀察菌落表面特征，菌絲呈白色，致密；其次是在蛋白胨和酵母膏氮源加富培養(yǎng)基上生長較快，菌落直徑分別比對照培養(yǎng)基上菌落直徑大1.60mm和1.55mm，菌落表面白色，較致密；在（NH4）2SO4氮源加富培養(yǎng)基上菌落生長速度最慢，與對照相近，接種7天后菌落直徑達到3.86mm，只比對照培養(yǎng)基上的菌落直徑大0.24mm。因此，通過試驗篩選出高氏1號氮源加富培養(yǎng)基為牛肉膏，其次為蛋白胨和酵母膏藥，而（NH4）2SO4氮源加富培養(yǎng)基生長上菌落生長最慢。

2.1.3 高氏1號維生素加富培養(yǎng)基的篩選

圖3 5406放線菌在高氏1號不同維生素加富培養(yǎng)基上生長情況

試驗結(jié)果見圖3。試驗結(jié)果表明，在高氏1號基礎培養(yǎng)基中添加不同供試維生素，5406放線菌菌落生長速度的影響是不同的。從圖3中可以看出，5406放線菌在添加VB1加富培養(yǎng)基上菌落生長最快，接種7天后菌落直徑達到6.24mm，比對照培養(yǎng)基上菌落直徑大2.62mm，觀察菌落表面特征，菌絲呈白色，致密；其次是在VB12加富培養(yǎng)基上生長較快，菌落直徑分別比對照培養(yǎng)基上菌落直徑大2.25mm，在VB6加富培養(yǎng)基上菌落直徑比對照培養(yǎng)基上菌落直徑大1.84mm；在VB2加富培養(yǎng)基上菌落生長速度最慢，比對照培養(yǎng)基上菌落直徑大1.23mm；因此，通過試驗篩選出高氏1號維生素加富培養(yǎng)基為VB1，其次為VB12，在VB2加富培養(yǎng)基生長上菌絲生長最慢。

2.2 高氏1號加富培養(yǎng)基最適配方的確定

試驗結(jié)果見表3。由表3可知，不同組合之間5406放線菌菌落生長速度是不同的，以A3B2C1D3組合放線菌菌落的生長速度最快，菌落的平均直徑為6.64mm，菌落表面為白色，菌落表面致密，長勢好。從極差分析結(jié)果可以看出，對5406放線菌生長速率影響的排序為麥芽糖＞pH＞VB1＞牛肉膏，通過試驗確定高氏1號加富培養(yǎng)基最適配方為可溶性淀粉20g、麥芽糖15g、牛肉膏4g、B120.1g、KNO33g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、NaCL0.5g、瓊脂 18g、H2O1000mL、pH 為 7.5。

表3L9（34）正交試驗結(jié)果

2.3 5406放線菌生長環(huán)境條件的單因素試驗結(jié)果

2.3.1 5406放線菌生長適宜溫度的確定

圖4 不同溫度對5406放線菌生長的影響

試驗結(jié)果見圖4。由圖4可知，5406放線菌菌落隨著溫度的升高，生長速度逐漸加快，在35℃下生長速度最快，培養(yǎng)7天菌落直徑達6.35mm，菌落表面白色致密，長勢好，當超過35℃時，生長速度逐漸下降，當溫度達到45℃時，培養(yǎng)7天的菌落直徑為3.24mm，菌落表面菌絲稀疏，長勢差。由此可知，5406放線菌生長的適宜溫度為35℃。

2.3.2 5406放線菌生長適宜空氣相對濕度的確定

圖5 不同空氣相對濕度對5406放線菌生長的影響

試驗結(jié)果見圖5。由圖5可知，5406放線菌菌落隨著空氣相對濕度的升高，生長速度逐漸加快，當空氣相對濕度達到60%時，生長速度最快，培養(yǎng)7天菌落直徑達6.54mm，菌落表面白色致密，長勢好；當空氣濕度超過60%時，菌落的生長速度逐漸下降，特別是空氣濕度達到80%時，平板培養(yǎng)基污染較重，表明5406放線菌不宜在高濕條件下培養(yǎng)，最適的空氣相對濕度為60%左右。2.3.3 5406放線菌生長的適宜光照條件的確定

試驗結(jié)果見圖6。由圖6可知，5406放線菌菌落在無光或弱光條件生長速度較快，隨著光照的增強，生長速度逐漸下降。觀察菌落表面特征，在無光或弱光條件下菌落致密，較厚，長勢好；當光照達到300Lx后，菌落薄，長勢較差。

圖6 不同光照強度對5406放線菌生長的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 在高氏1號碳源加富培養(yǎng)基的篩選試驗中，從理論上看葡萄糖作為單糖要比雙糖更容易被吸收，但本研究中在高氏1號基礎培養(yǎng)基中加入麥芽糖為速效碳源時，5406放線菌菌落生長速度最快，長勢最好，說明麥芽糖更易于5406放線菌吸收利用；進行高氏1號氮源加富培養(yǎng)基篩選時，試驗結(jié)果證明有機氮源有利于5406放線菌吸收和利用，特別是牛肉膏氮源加富培養(yǎng)基，菌落的生長的較快，長勢好，而在高氏1號基礎培養(yǎng)基中加入無機氮源（NH4）2SO4時，菌落的生長速度與對照相近，說明5406放線菌對無機氮源吸收利用不充分；在高氏1號維生素加富培養(yǎng)基篩選試驗中，添加不同的維生素時5406放線菌與對照相比較均有促進作用，添加VB1和VB12時效果最佳。

3.2 試驗結(jié)果表明，所用的高氏1號加富培養(yǎng)基與高氏1號基礎

培養(yǎng)基（對照）相比，均能夠促進5406放線菌的生長，但通過正交試驗篩選出適合5406放線菌生長的高氏1號加富培養(yǎng)基配方為可溶性淀粉20g、麥芽糖15g、牛肉膏4g、B10.1g、KNO33g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、NaCL 0.5g、瓊脂 18g、H2O1000mL、pH為7.5。該配方與高氏1號基礎培養(yǎng)基相比，營養(yǎng)更充分，更有利于5406放線菌的生長。

3.3 5406放線菌生長不僅需要充足的營養(yǎng)條件，還需要適宜的環(huán)境條件。為了確定5406放線菌生長適宜的環(huán)境條件，本試驗對溫度、光照、空氣相對濕度進行了單因素試驗研究。試驗結(jié)果表明，5406放線菌生長適宜的環(huán)境條件為適宜溫度為35℃，適宜的空氣相對濕度為60%左右，在無光或弱光條件下生長快，菌落較厚，表面致密，長勢好。

[1] 崢嶸.5406放線菌對小麥幼苗的影響[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版），2006，（02）：150-152.

[2] 張彥麗，谷思玉，曾祥書.低磷土壤接種微生物壯秧劑對水稻秧苗吸收氮磷鉀的影響[J].中國農(nóng)學通報，2007，（07）:370-374.

[3] 孟煥文，程智慧，冀瑞瑞.放線菌劑和種衣劑對西瓜防病壯苗的效果[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2007，（08）：109-113+120.

[4] 孫敬祖，薛泉宏，唐明.放線菌制劑對連作草莓根區(qū)微生物區(qū)系的影響及其防病促生作用[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2009，37（12）:153-158.

[5] 李智.5406抗生菌肥特性及使用方法[J].生物加工過程，2003，（02）：50-52.

[6] 朱宏建，易圖永，周鑫鈺.土壤放線菌生防活性物質(zhì)的研究進展[J].作物研究，2007，（02）：149-151.

[7] 孫磊，程顯好，李維煥.菌落直徑法和菌絲干重法在優(yōu)化真姬菇菌種固體斜面培養(yǎng)條件的比較[J].中國食用菌，2015，34（03）：28-32.

[8]王玄靜.正交試驗設計的應用及分析 [J].蘭州文理學院學報（自然科學版）2016，30（01）：17-22.