HPLC測(cè)定養(yǎng)陰生津片中丹皮酚和五味子醇甲的含量

蔡勇科 張火旺 邱治漢 黃秀琴

1.廣東省河源市中醫(yī)院，廣東河源 517000；2.廣東省河源市藥品藥檢所，廣東河源 517000

養(yǎng)陰生津片由地黃、黃芪、牡丹皮、五味子、枸杞子、黃連、石斛、紅參、石膏、麥冬、山藥、茯苓等13味中藥組成，具有滋補(bǔ)腎陰，生津止渴，益氣降糖等作用[1-3]。臨床主要用于成年人非胰島素依賴性輕型、中型糖尿病。在現(xiàn)行藥物標(biāo)準(zhǔn)[4]中，養(yǎng)陰生津片中僅有定性檢測(cè)，河源市科技局項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：2016-56，養(yǎng)陰生津片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中，只是研究黃芪甲苷含量測(cè)定，而對(duì)其他成分的含量測(cè)定少有提及，從而很難有明確證據(jù)確定藥劑質(zhì)量及藥物的安全性能[5]。本項(xiàng)目除研究黃芪甲苷含量外，再后續(xù)研究牡丹皮和五味子，丹皮酚及五味子醇甲是分別來(lái)自牡丹皮及五味子中的有效成分，是養(yǎng)陰生津片發(fā)揮藥效的重要成分[6-7]。因此選取此兩種成分作為含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，擬采用高效液相色譜法（HPLC）建立測(cè)定模型并實(shí)施含量測(cè)定，本試驗(yàn)的液相條件簡(jiǎn)單快速，分離度好，為有效進(jìn)行該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了很好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

島津LC-2010AHT（日本島津）高效液相色譜儀，CP225D型多功能電子分析天平，SB2200超聲處理器（上海科導(dǎo)超聲清洗儀有限公司）。

1.2 試劑

乙腈（色譜純，TEDIA），磷酸（廣州市番禺力強(qiáng)化工廠生產(chǎn)，分析純），超純水；丹皮酚對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，110708-201407）；五味子醇甲對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，110857-201714）；養(yǎng)陰生津片（市中醫(yī)院提供3批次，批號(hào)分別為：20170801，20170901，20170902）。

2 方法

2.1 相關(guān)溶液的配制方法

丹皮酚對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的配制：以電子天平稱取丹皮酚對(duì)照品10.12mg于100mL容量量瓶中，然后以50%甲醇溶液溶解至刻度并充分混勻即得。五味子醇甲對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的配制：以分析天平準(zhǔn)確稱取10.05mg五味子醇甲對(duì)照品，并置于100mL量瓶中，以50%濃度甲醇溶液溶解充分混勻并加量至刻度即得。對(duì)照品溶液的配制：以量筒分別精確量取上述配制好的兩種儲(chǔ)備溶液各5.0mL置于25mL量瓶中，同樣以50%濃度甲醇溶液混勻后加至刻度，分別以0.45μm濾膜濾過(guò)即可。待檢樣品溶液的配制：分別取3批次待檢養(yǎng)陰生津片樣品20片，人工去除藥片表面糖衣，用研缽研碎，以分析天平分別精確稱取1.0g置于具塞錐形瓶，加入50%甲醇溶液50.00mL后閉塞，稱重，然后以16KHZ，296W超聲處理30min后自然冷卻，再次稱重，比較兩次重量的差距，以50%甲醇液補(bǔ)充至超聲處理前重量，充分?jǐn)噭蚝鬄V過(guò)，取出續(xù)濾液，于0.45μm微孔濾膜上過(guò)濾，即得樣品。陰性對(duì)照液的配制：按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的處方比例同法配制不含牡丹皮、五味子的陰性樣品，按樣品液配制方法法配制成相應(yīng)的陰性對(duì)照液。

2.2 色譜條件及進(jìn)樣分析

Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm）填充柱，流動(dòng)相為乙腈-0.1 %磷酸溶液（B），時(shí)間濃度梯度洗脫設(shè)置為：30%A（0min）、45%A（15min）、50%A（30min）、30%A（35min）；檢測(cè)波長(zhǎng)為 260nm，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為20μL，柱溫25℃；以峰面積外標(biāo)法定量。在本色譜條件下，養(yǎng)陰生津片中丹皮酚及五味子醇甲的色譜峰與其他組分峰均取得較好分離，干擾性較小。

3 結(jié)果

3.1 干擾測(cè)試結(jié)果

分別量取上述配置好的丹皮酚及五味子醇甲對(duì)照品溶液、待檢樣品溶液及陰性對(duì)照液，在上述既定色譜條件下進(jìn)樣，并進(jìn)行HPLC測(cè)繪出相應(yīng)圖譜，結(jié)果顯示丹皮酚及五味子醇甲兩組分的峰值出現(xiàn)時(shí)間區(qū)域內(nèi)無(wú)其他干擾峰波，表明樣品中其他成分均對(duì)樣品測(cè)定無(wú)明顯干擾。見(jiàn)圖1。

3.2 線性關(guān)系的考察

分別精密量取丹皮酚及五味子醇甲對(duì)照品儲(chǔ)備液 5、10、15、20、25、30μL 置于量瓶中，通過(guò)甲醇定容至要求刻度，充分搖勻后得到一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在上述色譜條件下分別進(jìn)樣20μL，進(jìn)行峰面積的測(cè)定，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得回歸方程。丹皮酚A=134040C+18016（r=0.9996），五味子醇甲A=216687C-26165（r=0.9992），結(jié)果表明丹皮酚溶液濃度在0.5060～3.0360μg，五味子醇甲溶液濃度在0.1005～0.6030μg范圍內(nèi)均與各自峰面積線性關(guān)系良好。

3.3 HPLC測(cè)定方法特性分析

取同一對(duì)照品溶液連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量20μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD分別為RSD（丹皮酚）=0.8%（n=6），RSD（五味子醇甲）=0.9%（n=6），結(jié)果表明該方法使用的儀器具有良好精密度；取同一批號(hào)供試品，精密稱取6份，按樣品測(cè)定方法平行測(cè)定含量，丹皮酚的RSD為1.05%（n=6），五味子醇甲的RSD=1.10%（n=6），結(jié)果表明該方法重復(fù)性好；取同一樣品溶液，在室溫放置，每隔2 h測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果丹皮酚的RSD為1.07%（n=6），五味子醇甲的RSD=1.15%（n=6），說(shuō)明樣品溶液在12 h內(nèi)測(cè)定，結(jié)果穩(wěn)定性良好。

3.4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

精密稱取已知丹皮酚及五味子醇甲含量的適量樣品（20170801，丹皮酚含量：0.335mg/g，五味子醇甲含量：0.141mg/g）至具塞錐形瓶中，共6份，分別加入上述丹皮酚及五味子醇甲對(duì)照品儲(chǔ)備液（其中丹皮酚儲(chǔ)備液3.00mL與五味子醇甲儲(chǔ)備液10.00mL，置于25mL量瓶中，用甲醇溶液溶解至刻度，作為混合對(duì)照品溶液，丹皮酚濃度為0.0607mg/mL、五味子醇甲濃度為 0.0402mg/mL）1mL，2mL，3mL，密塞，稱定重量，超聲處理（16KHz，296W）30min，自然冷卻后再次稱重，兩次稱重的差距以50%甲醇補(bǔ)充，充分搖勻后濾過(guò)，取過(guò)濾液，用微孔濾膜（0.45μm）再次過(guò)濾即得。分別量取以上6份溶液20μL，注入液相色譜議進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算丹皮酚及五味子醇甲的回收率。見(jiàn)表1。

3.5 養(yǎng)陰生津片樣品中丹皮酚及五味子醇甲含量測(cè)定

取不同時(shí)間生產(chǎn)的三批養(yǎng)陰生津片進(jìn)行丹皮酚及五味子醇甲含量的測(cè)定，按2.1方法進(jìn)行配制待測(cè)樣品液，進(jìn)樣20μL，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算丹皮酚及五味子醇甲含量。根據(jù)三批樣品所測(cè)丹皮酚及五味子醇甲含量結(jié)果，暫定養(yǎng)陰生津片中丹皮酚含量定量限為0.3mg/g，五味子醇甲含量定量限為0.1mg/g。見(jiàn)表2。

表1 養(yǎng)陰生津片回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

4 討論

養(yǎng)陰生津片是目前臨床應(yīng)用較廣泛的一類中成藥物，可養(yǎng)陰益氣，清熱活血，降糖補(bǔ)腎，主要用于非胰島素依賴性的輕中度糖尿病的治療[8-9]。牡丹皮和五味子是其發(fā)揮作用的重要組分，其中牡丹皮具有清熱涼血、活血清熱的功用，五味子則具有益氣生津、補(bǔ)腎降糖的作用，能明顯改善糖尿病患者腎陰虛、高血糖癥狀[10-11]。而丹皮酚及五味子醇甲分別是牡丹皮和五味子中的活性成分，因此，本文選取養(yǎng)陰生津片中丹皮酚及五味子醇甲含量的測(cè)定來(lái)評(píng)估藥物藥效具有很強(qiáng)的說(shuō)服力[12-13]。

高效液相色譜法（HPLC）在選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，波長(zhǎng)設(shè)置為260nm時(shí)，丹皮酚及五味子醇甲的吸收率均達(dá)最大，測(cè)量的靈敏度較高，此外，設(shè)置此長(zhǎng)度波長(zhǎng)時(shí)，色譜峰對(duì)稱分布，干擾小，效果佳，故選擇260nm作為最終樣品的檢測(cè)波長(zhǎng)[14]。提取方法的選擇 以乙腈-水-磷酸、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸等不同流動(dòng)相進(jìn)行研究，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相，兩種成分分離較好。分別通過(guò)超聲處理樣品 10min，20min，30min，40min 四個(gè)時(shí)間跨度，最終測(cè)得樣品的含量最高的為超聲處理30min和40min組，故認(rèn)為在超聲30min基本提取完全，故最終選用甲醇超聲處理30min[15-16]。

本試驗(yàn)以高效液相色譜法（HPLC）法測(cè)定養(yǎng)陰生津片中丹皮酚及五味子醇甲含量，通過(guò)測(cè)試，最終確定以260nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，50%甲醇為提取液，提取時(shí)間設(shè)置為30min，可獲得精確、可重復(fù)和穩(wěn)定的測(cè)定結(jié)果。該法操作較為便捷，樣品回收率高，穩(wěn)定性高，重復(fù)性好，是養(yǎng)陰生津片質(zhì)量控制的有效方法，因此本法的建立有利于更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

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