嚴重少弱精子癥患者微量精子凍融后行卵胞漿內單精子注射的妊娠結局分析

吳賢玲，喻喬，羅樹偉，黃啟江，謝舜

(湖南省計劃生育研究所，長沙 410000)

男方因素導致的不育約占不育人群的30%～40%[1]，嚴重少弱精子癥患者精子密度<1～5×106/ml，高倍視野的精液參數呈現波動[2]，有時甚至幾個高倍視野才發現1條活動精子。這類患者在進行輔助生殖技術時，我們要提前對其精子進行冷凍，儲備一定數量的精子以滿足取卵日對精子的需求。常規精液冷凍對嚴重少弱精子癥患者應用效果較差，且較難回收精子，隨著技術的發展，可以對嚴重少弱精子癥患者采取微量精子冷凍保存[2]，然后行微量精子凍融后卵胞漿內單精子注射(ICSI)，但其臨床應用效果如何目前還不太明確。本研究旨在對微量精子凍融后行ICSI的妊娠結局進行分析，以期為嚴重少弱精子癥患者的臨床治療提供參考。

一、資料與方法

1. 研究對象及分組：回顧性分析2015年1月至2016年6月在本中心行輔助生殖技術助孕的嚴重少弱精子癥患者96例(100個治療周期)的臨床資料。納入標準：(1)所有患者經至少3次精液常規分析檢查后診斷為嚴重少弱精子癥(精子濃度<1～5×106/ml)，排出精液高倍鏡下能夠找到活動精子，精液體積大于1 ml；(2)所有患者均為男性因素不育；(3)無家族病史。排除標準：夫妻雙方染色體檢查結果不正常者。

根據所用精子的不同進行分組：43例患者(45個周期)使用凍融精子，即凍融精子組；53例患者(55個周期)使用新鮮精子，即新鮮精子組。

2.精液標本的收集和處理：所有患者均于禁欲2～5 d后自慰方式取精，取精前排小便，清潔會陰，手淫法將精液完整收集到一次性無菌無毒的專用取精杯內，標本采集在本中心指定的取精室進行。精液取出后立即置于37℃恒溫箱中液化15 min，加入精子分離上下層梯度介質(Isolate，Irvine，美國)洗滌精液1次，去上清后加入1 ml洗精受精液(G-IVF，Vitrolife，瑞典)進行離心，離心1次后去上清，并保留少量液體于離心管中，輕輕晃動離心管混勻精液后，取少量洗滌后的精液于顯微鏡下觀察都有活動精子。凍融精子組對精子進行微量冷凍，以1∶1比例加入已預溫的精子冷凍液混勻后冷凍；新鮮精子組則取少量沉淀置于離心管中等待ICSI使用。精液質量評估標準參考世界衛生組織(WHO)《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版[3]內容。

3.促排卵方案：所有患者均采用標準黃體期短效長方案，黃體中期開始皮下注射曲普瑞林(達必佳，輝凌，德國)0.1 mg/d，降調18 d，達到降調標準后，予重組人卵泡刺激素(果納芬，默克雪蘭諾，瑞士)150～225 U/d和人絕經期促性腺激素(樂得寶，珠海麗珠)75 U/d促排卵，當優勢卵泡直徑≥18 mm時，于當晚注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)5 000～10 000 U，34～36 h后常規超聲引導下行取卵術，于體視鏡下獲取卵冠丘復合物，將卵冠丘復合置于G-IVF受精液中培養。

4.精子微量冷凍及復蘇：雙人核對確認后，將離心后的精液沉淀與精子冷凍液(Irvine，美國)1∶1混勻，取少量混勻液放置于冷凍麥管上，在液氮上方停留數分鐘后投入液氮內保存。解凍時，雙人核對確認后，從液氮中取出冷凍的精液，置于37℃石蠟培養油(Vitrolife，瑞典)中快速復溫，準備行ICSI操作。本研究凍融精子組微量精子凍融復蘇后均能找到活動精子用于ICSI操作。

5. ICSI及妊娠判斷：HCG注射后39～40 h拆除顆粒細胞，選擇MⅡ期卵母細胞行ICSI操作。第1天觀察受精情況，第2天觀察胚胎卵裂情況，第3天觀察胚胎卵裂情況并進行評分，評判出優質胚胎和可利用胚胎。優質胚胎評價標準：取卵后第1天(D1)觀察為雙原核(2PN)，D2無多核現象，D3的細胞數≥7細胞，細胞大小均一或略有不均，形狀基本規則，碎片≤20%。所有患者根據個人意愿及胚胎情況移植1～2枚胚胎，移植胚胎均達到胚胎評價標準中的可用胚胎。

移植后12 d測晨尿并同時抽血，如HCG(+)則為生化妊娠，移植后28 d行B超檢查提示孕囊及心管搏動者則為臨床妊娠。

二、結果

1. 兩組患者一般情況比較：兩組患者的女方年齡、不育年限、獲卵數、移植胚胎數比較均無統計學差異(P0.05)(表1)。

2. 兩組患者臨床結局比較：兩組患者的受精率、優胚率、可利用胚胎率、生化妊娠率、臨床妊娠率、流產率比較均無統計學差異(P0.05)(表2)。

表1 兩組患者一般情況比較(-±s)

表2 兩組患者臨床結局比較(%)

三、討論

有學者研究認為，冷凍精子并不會影響小鼠的胚胎發育和表觀遺傳重組動態進程[4]。Di santo等[5]的研究表明，精子短暫接觸冷凍保護劑，凍存在液氮內，可保存很長時間，并且冷凍復蘇精子組的妊娠率和新鮮精子組對比無顯著差異，精子質量不會隨時間推移而有明顯不良改變。Feldschuh等[6]報道使用冷凍28年的精子授精后成功出生了孩子。因此精子冷凍保存是一種安全有效的保存男性生育能力的方法。ICSI已作為常規技術應用于輔助生殖領域，精液冷凍結合ICSI技術為少精子癥患者帶來了福音，且有研究證實精液的質量和來源并不影響ICSI的受精及早期妊娠結局[7-8]。無精子癥和嚴重少弱精子癥等嚴重男性不育癥患者行ICSI助孕，其子代的出生缺陷情況與其他較好精子或正常精子行ICSI/IVF助孕的子代相比無明顯增加，Y染色體AZF基因檢測也沒有新增缺失位點和病例，這在一定程度上解除了為這些子代身心健康的擔憂[9]。

本中心采用的微量自精凍融方法，對于嚴重少弱精子癥精患者或者需多次冷凍才能儲備一定數量的精子以滿足取卵日需求的患者，有十分重要的意義。程序冷凍或非程序的緩慢冷凍是兩種傳統的精子冷凍保存方法，冷凍過程中經歷的理化效應直接作用于精子，造成DNA損傷、DNA碎片指數升高[10]，以及精子膜結構不可逆的損傷等。對于中重度少弱精子癥患者而言，采用常規的冷凍方法會使極少量的精子暴露在大量高濃度的滲透性冷凍保護劑中，會加劇冷凍過程對精子的損傷作用，從而達不到良好的冷凍效果[11]。有研究表明，低活力的精子核DNA冷凍耐受性比高活力的精子差，其核DNA在冷凍過程中容易受損[12]。精子染色質異常或DNA受損均可導致受精失敗、胚胎發育異常、妊娠率降低[13]。有研究證實，快速冷凍不會導致細胞內大量冰晶的形成，從而降低對精子的損傷[14]。本中心所使用的微量冷凍法，采用快速冷凍法，將精子在液氮上方停留5～8 min后投入液氮內保存，這種方法的冷凍速率高于常規冷凍，雖稍低于直接投入液氮內的冷凍方式，但其同時配合以麥管作為冷凍載體的小體積冷凍法還提高了冷凍速率。此外，嚴重少弱精子癥患者的精子數目少、活力弱，冷凍過程則進一步降低精子的數目及活力，常規冷凍復蘇后精子活動率及回收率低[15]。劉項等[16]對中重度少弱精子癥患者的凍融精子與新鮮精子的ICSI臨床結局進行比較，發現常規的冷凍方法其可利用胚胎率和優胚率顯著低于新鮮對照組，提示常規冷凍方法可能并不適合嚴重少弱精子癥患者的精子冷凍。本中心采用的復溫是置于37℃液體中以達到快速復溫的目的，避免再生冰晶和脫玻化，能最大程度保證精子活動率及回收率。目前在進行ICSI操作時，ICSI皿中的精子滴我們采用的是回行滴，盡量選用游至相對干凈處的精子，在聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Irvine，美國)內進行清洗，防止將精子冷凍液帶入卵母細胞漿內。本中心嚴重少弱精子癥凍融精子組與新鮮精子組的受精率、卵裂率、優質胚胎率、可利用胚胎率、生化妊娠率、臨床妊娠率、流產率比較均無統計學差異，提示微量精子冷凍并不影響少弱精子癥患者的妊娠結局。

但因為嚴重少弱精子癥患者的病因各異，主要由遺傳因素和環境因素引起，在研究中應考慮到染色體異常的因素，本研究中未進行患者內分泌激素水平檢查和染色體分析，可能對研究結果造成一定影響。后續研究應進一步完善實驗設計，擴大樣本量進行深入分析。

綜上所述，嚴重少弱精子癥患者微量精子凍融后行ICSI可以獲得與新鮮精子ICSI相似的妊娠結局，但仍需后續更大樣本量的前瞻性研究加以探討驗證。

【參 考 文 獻】

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