豬肉中賽庚啶殘留檢測提取方法探究

張 晶 福建省農產品質量安全檢驗檢測中心 福州 350003

賽庚啶（二苯環庚啶，Cyproheptadine）為抗過敏藥，主要用于治療人的過敏性疾病。由于賽庚啶可在動物下丘腦食欲中樞對5-羥色胺拮抗，抑制下丘腦的飽覺中樞而刺激食欲、增加體重，因此，賽庚啶在動物養殖中非法使用后果較嚴重。2010年，農業部1519號公告將賽庚啶列入了《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質》，制定了農業部標準《飼料中可樂定和賽庚啶的測定》[1]，并納入全國飼料質量安全

監測工作中。統計近幾年的監測結果，發現豬飼料陽性率比較高。賽庚啶具有中樞神經系統抑制作用，人服用后會出現嗜睡、鎮靜、頭暈、反應力下降等毒副作用。 目前，已開展對動物組織[2]、豬尿[3]、飼料[4]等方法研究，尚無豬肉中賽庚啶殘留檢測方法的相關標準。本文探索對豬肉中賽庚啶殘留物不同前處理提取方法比較，確定經酶解提取、離心凈化后，采用超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）法測定豬肉中賽庚啶殘留量，能有效排除干擾，而且該方法快速、簡便、準確，可用于豬肉中賽庚啶殘留量的測定。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器 超高效液相色譜串聯質譜儀（Waters TQ-SUPLC/MS/MS）；瑞士梅特勒-托利多電子天平（AX105，感量 0.00 001 g）；奧豪斯電子天平（AR3130，感量0.001 g）；美國科俊高速冷凍離心機（D-37520）；美國 Organomation 氮吹儀（N-EVAP）。

1.2 對照品 鹽酸賽庚啶對照品，含量100%，批號usp1161000，由BESTOWN公司提供。

1.3 試劑 甲醇、甲酸、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.4 賽庚啶貯備液的配制 精密稱取鹽酸賽庚啶對照品，用甲醇配制成含賽庚啶為1.0 mg/mL的標準貯備液。

1.5 賽庚啶對照品工作液的配制 精密量取適量賽庚啶貯備液，用乙腈-0.1%甲酸溶液（30∶70）稀釋成含賽庚啶為100 ng/mL的對照品工作液。

1.6 賽庚啶系列標準工作液的配制 精密量取適量賽庚啶對照品工作液，用乙腈-0.1%甲酸溶液（30∶70）稀釋成賽庚啶濃度為 0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL 系列標準工作液。

2 儀器條件

2.1 液相色譜條件 色譜柱：BEH C18（100 mm×2.1 mm），粒徑：1.7 μm，柱溫：30 ℃，進樣量：1 μL，流速：0.3 mL/min；流動相A為 0.1%甲醇，B為0.1%甲酸水溶液。 梯度洗脫程序：0～4 min，30%～60%A；4～4.6 min，60%～90%A；4.6～4.8 min，90%～30%A；4.8～6.0 min，30%A。

2.2 質譜條件離子源模式 電噴霧正離子源模式（ESI+）；檢測方式：多反應監測 （MRM）：源溫：110℃；溶劑溫度：500℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/h；毛細管氣壓：0.5 KV。定性離子對、定量離子對及對應的錐孔電壓和碰撞能量見表1。

2.3 樣品前處理方法的確定 豬肉組織預處理常用的方法有酸水解法、堿水解法、酶水解法、有機溶劑提取法等。

2.3.1 堿水解法 豬肉用0.1～2.5 mol/L氫氧化鈉（鉀）溶液中80℃水解30 min。堿水解法可使豬肉溶解，藥物釋放完全，但水解條件劇烈，適用于堿性條件下穩定的藥物。

2.3.2 酸水解法 豬肉用0.1～0.6 mol/L鹽酸溶液中45℃水解18 h。酸水解法條件比較溫和，適用范圍廣，釋放率較高。

2.3.3 有機溶劑提取法 用甲醇超聲提取1～2 h。該法簡便、適用范圍廣，但藥物釋放不完全且雜質多。

2.3.4 酶水解法 多采用葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶。酶水解法條件溫和，不引起藥物分解，是分析不穩定性化合物的首選方法，該法不足之處在于價格昂貴。

2.3.5 方法比較 對陽性豬肉樣品進行水解效率比較試驗，試驗步驟如下。

2.3.5.1 堿水解法 稱取豬肉2 g，加入5 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，65℃水解4 h。

2.3.5.2 酸水解法 稱取豬肉2 g，加入5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，65℃水解4 h。

2.3.5.3 酶水解法1 稱取豬肉2 g，加入5 mL 0.2 mol/L乙酸銨溶液（pH5.2），65℃酶解 4 h。

2.3.5.4 酶水解法2 稱取豬肉2 g，加入5 mL 0.2 mol/L乙酸銨溶液（pH5.2），37℃酶解 16 h。

試驗結果表明，堿水解法提取效率最差；兩種酶解法也同時做了不同酶解溫度和酶解時間差別的比較，結果表明37℃酶解16 h的效率較高；酸水解雖然與酶水解的效果相當，但該方法提取效率較低，因此，最終選擇37℃酶解16 h為豬肉水解方法。結果見圖1。

圖1 不同水解方法比較

2.4 樣品提取、凈化 取試樣（2.0±0.05 g）于50 mL離心管中，加入乙酸銨緩沖液（稱取15.4 g乙酸銨，溶解于1 000 mL水中，用適量乙酸調pH至 5.2）5 mL和β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40 μL，混勻，37℃下避光水浴振蕩16 h。加入鹽酸溶液500 μL，混勻，再加入乙腈-0.1 mol/L的鹽酸提取溶液5 mL，混勻，5 000 r/min離心5 min，取上清液，備用。混合型強陽離子交換柱MCX（Waters，60 mg，3 cc）依次用甲醇3 mL和水3 mL活化，備用液全部過柱，分別用水3 mL和甲醇3 mL淋洗，用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脫，洗脫液50℃氮氣吹干，用乙腈-0.1%甲酸溶液0.5 mL溶解殘余物，0.22 μm 濾膜過濾，待測。

表1 賽庚啶的定性、定量離子對及錐孔電壓、碰撞能量參考值

3 結果與分析

3.1 線性關系的考察 賽庚啶對照品工作液適量，用乙腈-0.1%甲酸溶液（30∶70）稀釋成賽庚啶濃度為0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL系列標準工作液，供超高效液相色譜-串聯質譜法測定。線性結果為Y=0.316016X+0.000853419，相關系數r=0.999166，結果見圖2。

圖2 賽庚啶標準曲線線性圖

3.2 添加回收與精密度 以空白豬肉作為測試對象，按2.4項下步驟，進行加標回收率試驗，以考察方法的準確度和重現性。 配制 0.25 μg/kg、0.5 μg/kg、1 μg/kg 和 10 μg/kg 四個濃度的試樣，每批次內同一濃度做6次平行試驗，共重復3批次。結果見表2、圖3-圖 4。

表2 批內回收率(n＝6)和批間回收率(n＝3)試驗結果

4 討 論

通過賽庚啶前處理方法的改進和優化，可增強樣品中賽庚啶藥物的提取效率，從而提高回收率和改善待測組分色譜峰形。用本方法檢測豬肉組織中賽庚啶的殘留，不但目標化合物與雜質分離效果好，而且準確度和靈敏度較高，是一種比較理想的分析方法，具有較強的可行性和實用性。

圖3 賽庚啶標準品(1 μg/L)

圖4 賽庚啶陽性添加樣(0.25 μg/kg)

[1]中華人民共和國農業部.農業部1486號公告-2-2010飼料中可樂定和賽庚啶的測定 液相色譜-串聯質譜法[S].北京：中國農業出版社,2010.

[2]李丹妮,嚴鳳,周悅榕,等.QuEChERS-超高效液相色譜法-串聯質譜法同時檢測豬組織中賽庚啶及可樂定殘留量[J].中國獸藥雜志,2017,51(2)：29-34.

[3]曲斌,陸桂萍,蔣天梅,等.固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜法快速測定豬尿中的賽庚啶 [J].中國獸藥雜志,2013,47(1)：28-31.

[4]曹 瑩,蔣 音,張文剛.高效液相色譜法分析飼料中的賽庚啶[J].中國飼料,2011(2)：39-40.