應用ELISA法檢測HPRRS抗體的幾個影響因素分析

吳 蔚 南平市動物疫病預防控制中心 福建南平 353000

ELISA法，即酶聯(lián)免疫吸附法。由于其具有試劑產(chǎn)品穩(wěn)定、操作相對簡單、高靈敏性等優(yōu)點，是目前我國應用于基層動物疫病抗體檢測中的一種常用方法。在日常的免疫抗體效果監(jiān)測中，人工操作不可避免，而影響ELISA檢測結果的因素有很多，溫育時間、溫度、洗板次數(shù)等是其中的重要環(huán)節(jié)[1]。本文以檢測高致病性豬藍耳病抗體為例，就不同溫育時間、溫度、洗板次數(shù)，對比、分析可能引起ELISA試驗數(shù)據(jù)不成立（即試驗失敗）的原因及影響。

1 材料與方法

1.1 樣本與試劑 樣本選取經(jīng)過高致病性豬藍耳病疫苗免疫后呈現(xiàn)不同抗體效價的豬血清12份。試劑為豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測試劑盒（法國LSI）。

1.2 儀器 生化培養(yǎng)箱、微量移液器、酶標儀。

1.3 方法 將經(jīng)過高致病性豬藍耳病疫苗免疫后呈現(xiàn)不同抗體效價的豬血清12份進行編號 （1-12號）后分別做5個平行樣。以樣本1為例，取5個酶標反應板進行編號（板1-5），每份酶標板做12份樣品，陰陽性對照做雙份。酶標板1按照如下步驟操作：（1）按照試劑盒說明書將所有試劑回溫至室溫后混勻，配制洗液和樣本稀釋液。（2）對樣本1-12用樣本稀釋液稀釋后加入酶標板1的反應孔，陰陽性對照同時加入；蓋膜，37℃溫育60 min。（3）去膜洗板3次，拍干。（4）加酶標抗體。（5）蓋膜，37℃溫育 60 min。（6）去膜洗板 3 次，拍干。（7）加入底物溶液，輕搖后在20~25℃暗處作用10 min。（8）加入終止液，酶標儀（450 nm）讀數(shù)最終換算成IRPC值。全部在酶標板的過程大致為：加樣品－溫育－洗板－加酶標抗體－溫育－洗板－加底物－暗室作用－加終止液－讀數(shù)。與酶標板1不同的是，酶標板2在溫育階段均改為37℃溫育50 min，酶標板3在溫育階段均改為37℃溫育90 min，其他操作相同；酶標板4在暗處時改為28℃作用10 min，其他操作同板1；與酶標板1唯一不同的是，酶標板5在洗板次數(shù)上增加2次。見表1-表3。

表1 時間因素試驗條件設計

表2 溫度因素試驗條件設計

表3 洗板次數(shù)試驗條件設計

2 結 果

各板試驗結果見表4。與正常試驗相比，在溫育階段縮短溫育時間（如板2），試驗失敗（即陰陽性對照不成立，下同）；在暗處作用時，提高溫度（如板4），試驗失敗。現(xiàn)陰陽性對照不成立的問題。即使對照成立，也可能影響到結果的準確性，如人醫(yī)做HBsAg測定的室內(nèi)質(zhì)控中，就有出現(xiàn)弱陽性樣本測成陰性的情況[2]；而酶標板在暗處作用時，若環(huán)境溫度過高，如本次試驗

表4 各板試驗結果

對試驗結果成立的板1、板3及板5進行方差分析 （SPSS 17.0）， 結果見表 5。 F=0.013，P （sig）=0.987＞0.05，無顯著差異。

表5 板1、板3及板5的方差分析結果

3 討 論

本試驗是通過檢測高致病性豬藍耳病（HPRRS）抗體，探討在酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）中各種因素對試驗結果的影響。影響因素有很多，如血清的質(zhì)量、試劑保存情況、人工操作等。人工操作環(huán)節(jié)因試驗員不同，操作期間的影響因素較多，如溫育的時間、溫度、加樣方式、洗板次數(shù)等。鑒于因素太多，本試驗只選取了其中較為重要的、可能在操作過程中經(jīng)常出現(xiàn)的幾個因素來探討。

從試驗結果可見，溫育時間不夠或是周圍環(huán)境溫度過高都會導致試驗失敗。溫育時間不夠，試劑與樣本在酶標板上就沒有充足的反應時間，從而會出只增加3℃，試驗也失敗。日常獸醫(yī)試驗中我們常常會遇到需要適當延長溫育時間的例子，如試驗操作過程較長，而又恰巧在午餐時段；洗板時也會遇到個別試驗員擔心洗板不到位而人為增加洗板次數(shù)。通過對試驗成立的板1、板3及板5的方差分析可以看到，適當增加溫育時間及洗板次數(shù)對檢測高致病性豬藍耳病抗體效價影響并不大。

盡管有類似試驗結果表明，由于特殊原因，可以適當增加溫育時間及洗板次數(shù)[3-4]，但鑒于人工操作對試驗結果的影響因素較多，我們還是建議在基層獸醫(yī)試驗操作過程中，合理把握時間，嚴格按照說明書操作，盡量避免以上因素對試驗結果的影響。

[1]徐新蓉,龔國富,馬萍.ELISA檢測過程中影響因素及防控措施分析[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2013,34(1)：112-113.

[2]徐錫霞,鄧巍.溫育條件對ELISA定性測定HBsAg結果的影響[J].實用肝臟病雜志,2005,8(1)：16-18.

[3]單以軍.影響口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測實驗結果因素的研究[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2014(12)：21-23.

[4]帥敏,張玲,鄧曉琴,等.延長實驗溫育時間對FAME全自動酶免分析結果的影響 [J].臨床輸血與檢驗,2008,10(1)：28-30.