廣東某地區(qū)豬丹毒桿菌的分離鑒定與藥物敏感性分析

陸英杰，袁 生，鄧玉妹，李君養(yǎng)，柯駿鴻，盧玉葵

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231）

豬丹毒桿菌（Erysipelothrix rhuriopathiae）亦稱豬丹毒絲菌或丹毒絲菌，革蘭氏染色陽性，通常呈桿狀，但在心內(nèi)膜上分離到的病原菌菌體呈絲狀，是一種人獸共患病原菌。該病原菌通常和豬瘟、豬肺疫形成三聯(lián)苗在養(yǎng)豬業(yè)廣泛應(yīng)用，是養(yǎng)豬業(yè)有久遠(yuǎn)歷史的重要病原菌。該病菌可以引起豬的急性和亞急性敗血癥、慢性心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎，也能引起人的類丹毒［1-2］。由于豬瘟-豬肺疫和豬丹毒三聯(lián)苗的存在及抗生素的廣泛應(yīng)用，該病的防控獲得很好效果，我國已將近20年未見有該病的發(fā)生和報道［3］。但近幾年，豬丹毒舊病新發(fā)，在歐洲、日本和美國曾經(jīng)暴發(fā)過，而且被分離鑒定的血清型也非常多［4］，與此同時在我國江蘇、湖南、福建、云南等地也有該病暴發(fā)的報道，廣東廣州、佛山、清遠(yuǎn)等地的豬只也未能幸免，不僅造成幼齡豬只的急性死亡，同時成年豬只也出現(xiàn)急性和慢性豬丹毒特點(diǎn)，且死亡率不斷升高，給廣東地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時由于耐藥菌株的出現(xiàn)，為防治該病帶來一定的困難［5］。尤其當(dāng)該病出現(xiàn)，豬只將面臨合并感染而死亡，對養(yǎng)豬業(yè)的潛在危害很大，因此預(yù)防并及時防控該病是保障養(yǎng)豬業(yè)順利發(fā)展的關(guān)鍵。國內(nèi)外目前集中于豬丹毒檢測及耐藥菌株基因的檢測［6-7］及滅活苗或與其他病毒病聯(lián)合疫苗的研究［8］，因此及早鑒定該類疾病，深入了解豬丹毒病原菌對豬只造成臟器損傷以及對藥物的耐藥性，及時控制本病的蔓延和侵害是防制和研究的重點(diǎn)。為此，本試驗通過對廣東地區(qū)發(fā)生的豬丹毒桿菌病豬進(jìn)行病原的分離鑒定，獲得廣東地區(qū)流行的豬丹毒桿菌類型，經(jīng)16S rRNA通用引物的基因序列鑒定確定其血清型，同時對SPF級BALB/c實驗小鼠進(jìn)行臨床致病性實驗，觀察該病原菌對小鼠造成的病理損害，對機(jī)體免疫應(yīng)答產(chǎn)生的結(jié)果，以了解該病原產(chǎn)生病理損傷的原因；藥物敏感性實驗確定其對哪些藥物的敏感度比較強(qiáng)等，這些科學(xué)研究資料可以為進(jìn)一步研究該病奠定基礎(chǔ)，同時也為臨床防治該病找尋合適的藥物提供有價值的科研資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病料采自廣東某地區(qū)疑似豬丹毒病豬的心、肝和腎等器官；實驗動物SPF級BALB/c小鼠（25±0.1 g）購自廣東醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2013-0002。

主要試劑和儀器：PCR儀；16sRNA通用引物（上海生物工程科技有限公司）；多媒體圖像分析儀（Image-proplus，Media Cybernetics 公司，2005）；IMark 680酶聯(lián)免疫檢測儀（BIORAD公司，2015） ；IgM和IgG酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（南京建成工程研究所）；革蘭氏染色液1套，血液培養(yǎng)瓊脂（廣東環(huán)凱生物科技有限公司）；藥敏試紙片：青霉素G，鏈霉素，氨芐西林，頭孢氨芐，頭孢噻肟，林可霉素，頭孢克肟，阿奇霉素，恩諾沙星（規(guī)格：10 μg/片，廣州吉祥生物科技有限公司）

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離及形態(tài)學(xué)特性觀察 參照文獻(xiàn)［9］方法，將疑似豬丹毒桿菌的病豬進(jìn)行心、肝、腎組織分離后在無菌條件下劃線于血液瓊脂平板和半固體培養(yǎng)基，將獲得的菌落進(jìn)行涂片染色鏡檢，記錄細(xì)菌形態(tài)特征。保種，放于-20℃冰箱保存。

1.2.2 16S rRNA核苷酸序列鑒定及進(jìn)化樹分析 參照文獻(xiàn)［10-11］使用能夠擴(kuò)增大多數(shù)細(xì)菌16 S rRNA 基因的通用引物，上游引物：5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′；下游引物：5′-ACGGCTACCT TGTTACGACTT-3′，對所獲的基因片段進(jìn)行測序，將所獲得序列進(jìn)行Blast比對，并應(yīng)用DNAstar軟件的Multiple Sequence Aligment程序進(jìn)行多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.2.3 動物感染試驗 應(yīng)用30只BALB/c小鼠進(jìn)行感染試驗，通過飲水口服方法對小鼠進(jìn)行慢性感染，攻毒菌液濃度為107CFU/mL，觀察小鼠臨床變化，1周后眼球采血離心取血清置-20℃?zhèn)溆?；處死并剖檢感染小鼠觀察肝臟和脾臟等的臨床病理變化，同時采取小鼠的肝臟和脾臟進(jìn)行中性甲醛固定，制作石蠟切片，H.E染色方法觀察這些臟器的組織病理變化。

1.2.4 ELISA檢測小鼠IgM和IgG抗體 應(yīng)用ELISA檢測試劑盒對試驗小鼠進(jìn)行血清中IgM和IgG的檢測，方法參照試劑盒使用說明進(jìn)行。

1.2.5 藥敏性檢測 采用藥敏紙片擴(kuò)散法，將通過細(xì)菌的表型特征觀察以及引物擴(kuò)增并測序比對后鑒定的5株菌進(jìn)行血清肉湯培養(yǎng)，調(diào)整菌液濃度為107CFU/mL，然后將菌液均勻涂布在血液瓊脂平板上，貼上藥敏試紙片，37℃培養(yǎng)

24 h，測量抑菌圈大小并判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與16S rRNA的鑒定

臨床診斷疑似豬丹毒桿菌的病豬的肝、腎和脾進(jìn)行血液瓊脂平板的分離培養(yǎng)鑒定，獲得5株優(yōu)勢細(xì)菌，均形成針尖樣大小的灰白色菌落，不溶血，革蘭氏染色呈陽性桿菌，經(jīng)過16S rRNA通用引物基因序列鑒定后確定均為豬丹毒桿菌，這5株菌分別命名為GZSs1、GZSq1、GZSs2、GZSj1、GGZSs。應(yīng)用MEGA6軟件分析5株菌與已報道的具有完全基因序列的兩株豬丹毒桿菌GXBY-1和SY027兩株菌進(jìn)行親源關(guān)系的分析。分離菌株16S rRNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果和基因進(jìn)化樹分別見圖1和圖2。

圖1 分離菌株16S rRNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

由圖2可知，與已知GXBY-1和SY1027兩個豬丹毒菌株相比，本研究分離獲得的5株豬丹毒桿菌盡管在Blast比對中其親源關(guān)系非常近，但它們在進(jìn)化方面還是有明顯不同，其中a株和c株菌兩個進(jìn)化關(guān)系相近，而d株與已知的GXBY-1株進(jìn)化關(guān)系相近，b株和e株與其他菌株進(jìn)化關(guān)系則有很大差異。

圖2 5株分離菌與報道已知菌的基因進(jìn)化關(guān)系樹

2.2 ELISA檢測小鼠血清中IgM和IgG的結(jié)果

對照組小鼠抗體IgM含量為30.63（±8.09）ng/mL，與攻毒組IgM含量（116.03±22.83 ng/mL）相比差異顯著，對照組小鼠抗體IgG含量為21.11（±10.34）ng/mL，與攻毒組IgG含量（103.03±15.65 ng/mL）相比差異顯著。顯示口服致病小鼠盡管發(fā)病比較緩慢，但機(jī)體對病原刺激產(chǎn)生的抗體動力學(xué)規(guī)律是一樣的。

2.3 感染小鼠肝臟和脾臟的病理變化

2.3.1 豬丹毒感染小鼠肝臟的病理變化結(jié)果 從圖3（封三）可以看出，對照組肝臟的肝板結(jié)構(gòu)整齊，膽管與血管集中地方界限清晰，肝細(xì)胞有代謝增生但沒有空泡樣變性和壞死；而感染組肝臟的肝板結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞出現(xiàn)黃型的空泡樣變性和壞死現(xiàn)象，肝細(xì)胞腫脹，核碎裂、核消失現(xiàn)象非常明顯。

圖3 豬丹毒感染小鼠肝臟的病理變化結(jié)果（H.E×400）

2.3.2 豬丹毒感染小鼠脾臟的病理變化結(jié)果 圖4（封三）顯示，對照組脾小體結(jié)構(gòu)清楚，紅髓和白髓間隙清晰可見，結(jié)構(gòu)完整，無鐵紅素顆粒沉積；感染組脾小體結(jié)構(gòu)紊亂，紅白髓結(jié)構(gòu)紊亂混雜，淋巴細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死現(xiàn)象；而且有鐵紅素顆粒沉積，顯示黑色顆粒堆積的地方均為沉積的鐵紅素顆粒。

圖4 豬丹毒感染小鼠脾臟的病理變化結(jié)果（H.E×400）

2.4 藥敏檢測試驗結(jié)果

9種藥物對鑒定的5株菌藥物敏感性試驗結(jié)果見表1。從表1可以看出，a株、d株和e株菌對鏈霉素和林可霉素不敏感，對阿奇霉素和恩諾沙星中度敏感，對頭孢克肟高度敏感，對青霉素和氨芐西林極度敏感；而b株和c株菌對林可霉素不敏感，對鏈霉素和恩諾沙星中度敏感，對青霉素、頭孢氨芐、頭孢噻肟和氨芐西林均極度敏感，但兩株菌對阿奇霉素的表現(xiàn)不同，c株菌對阿奇霉素呈現(xiàn)極度敏感，對頭孢克肟高度敏感；但b株菌對阿奇霉素表現(xiàn)中度敏感，對頭孢克肟極度敏感。此種情況提示菌株對藥物的抵抗性有一定的差異。

表1 5株菌藥物敏感性試驗結(jié)果（mm）

3 結(jié)論與討論

3.1 豬丹毒桿菌對小鼠的感染

豬丹毒桿菌鑒定后，對SPF級小鼠進(jìn)行口服感染，通過感染發(fā)現(xiàn)小鼠對豬丹毒桿菌的感染具有一定的抵抗力，口服7 d內(nèi)與對照組相比，感染組進(jìn)食較多和排泄糞便有細(xì)微的變化之外，其他并未出現(xiàn)明顯的癥狀，口服7 d后處死小鼠，解剖發(fā)現(xiàn)心臟心肌變性，肝臟和脾臟有不同程度的壞死點(diǎn)和壞死區(qū)域，與臨床上致死豬只的心臟和肝臟變化一致，證明該病菌的致病性。口服感染與報道中腹腔注射不相同［12］，口服易受到消化系統(tǒng)的影響，但該病原可通過消化道、呼吸道以及環(huán)境污染物引起易感動物感染，而且在嚙齒類動物中也可分離到該菌，可見，小鼠既可以感染也可以是該病原的帶菌傳播者，感染的實驗動物呈心內(nèi)膜炎型［13］，而在實驗中證實了這些觀點(diǎn)，同時在剖檢中發(fā)現(xiàn)小鼠肝脾也出現(xiàn)變性、壞死、充血、出血等問題，但小鼠在臨床上并無典型癥狀表現(xiàn)，顯示小鼠是養(yǎng)豬業(yè)豬丹毒桿菌的重要傳播者，尤其是經(jīng)口服感染的小鼠危害性可能更大。

3.2 豬丹毒對小鼠肝脾以及IgM和IgG的影響

通過小鼠致病性實驗，觀察到該病不僅對心臟造成壞死性影響，而且對肝臟和脾臟也造成損傷，經(jīng)過病理觀察顯示該細(xì)菌肝脾造成的損傷，尤其是脾臟，它是免疫應(yīng)答的場所，紅髓和白髓的損傷會嚴(yán)重影響免疫細(xì)胞對免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，ELISA檢測的IgM和IgG的濃度顯示減少的B淋巴細(xì)胞參與體液免疫，而且脾臟紅髓在病理觀察中顯示損傷嚴(yán)重。此外，致病性實驗是通過口服進(jìn)行的，豬丹毒桿菌雖然經(jīng)過小鼠胃蛋白酶和酸性作用，但仍能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，而且其動力學(xué)規(guī)律仍然符合初次免疫應(yīng)答的規(guī)律，說明本試驗獲得的豬丹毒桿菌與文獻(xiàn)中闡述的耐酸性能好是一致的，且有很強(qiáng)的致病性［14］。

3.3 豬丹毒對藥物的敏感性

本試驗獲得5株豬丹毒桿菌，均來自于廣東佛山某些地區(qū)。通過藥敏片實驗發(fā)現(xiàn)，這5株菌均對青霉素和氨芐西林極度敏感，對鏈霉素有不同反應(yīng)；GZSs1、GZSj1、GGZSs這3株菌對鏈霉素不敏感，但GZSq1、GZSs2兩株菌對鏈霉素表現(xiàn)中度敏感，該實驗結(jié)果與20年前文獻(xiàn)報道的MIC方法進(jìn)行豬丹毒桿菌的藥物敏感性實驗具有一致性［15-16］，盡管MIC方法比藥敏片方法更為準(zhǔn)確但也顯示出豬丹毒桿菌的進(jìn)化對抗生素的敏感性。從本試驗基因進(jìn)化分析的圖譜中發(fā)現(xiàn)，5株菌基因進(jìn)化親源性存在差異，暗示其對抗生素的敏感度會有所不同。在頭孢噻肟、頭孢克肟、林可霉素、阿奇霉素及恩諾沙星等抗生素的藥物敏感性實驗中，說明基因進(jìn)化分析的可能，本試驗發(fā)現(xiàn)5種菌株對頭孢噻肟和恩諾沙星的重度和中度敏感與文獻(xiàn)報道安徽菌株的藥敏結(jié)果有所不同［11，16］，但對林可霉素的耐藥性方面有一致的實驗結(jié)果［5］。豬丹毒桿菌的耐藥性不僅與基因進(jìn)化有關(guān)，與生長環(huán)境等也有一定關(guān)系。

本試驗通過分離培養(yǎng)和16sRNA基因序列鑒定獲得5株豬丹毒桿菌，進(jìn)化分析顯示出同源性差異；對SPF級小鼠進(jìn)行攻毒試驗后，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生IgM和IgG抗體，產(chǎn)生含量與空白對照差異顯著；該菌嚴(yán)重?fù)p傷肝臟和脾臟，常規(guī)病理學(xué)變化顯示肝臟和脾臟細(xì)胞均有不同程度的變性和壞死，脾臟紅髓和白髓部分地方有鐵紅素沉積；藥物敏感性試驗證明5株菌對林可霉素均不敏感，部分對鏈霉素也不敏感；均對青霉素，氨芐西林和頭孢噻肟極度敏感，對頭孢氨芐重度敏感，阿奇霉素、恩諾沙星中度敏感顯示臨床上可以使用這兩種藥物進(jìn)行治療。

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