面向現場快速檢測的高分辨Blu-ray成像技術研究

徐鵬濤,任雙寶,張校亮

(1.中國船舶重工集團公司第七二三研究所,江蘇 揚州 225101;2.太原理工大學,山西 太原 030024)

0 引 言

傳統的生化檢測方法有酶聯免疫吸附法、分光光度法、色譜法和光譜法等，這些成熟的檢測方法存在檢測時間較長、檢測成本昂貴和儀器操作復雜等缺點。因此，許多研究致力于開發面向普通大眾的低成本現場快速檢測(POCT)設備。其中，利用大眾身邊常用的一些電子設備如手機、掃描儀和數碼相機等，通過對其簡單的改裝或者以編寫軟件的方式實現自定義的控制，進而使其作為生物分子傳感器的快速讀出設備有效地實現分子診斷或有害物質的檢測，是近年來的研究熱點[1-2]。隨著光盤技術的不斷發展，許多學者以標準光盤/光驅技術為基礎，研究了以光盤為反應基底、光驅為檢測器的生物化學檢測方法，將標準的或改裝后的光盤/光驅作為一種新型的POCT工具，廣泛運用到諸多檢測領域。這種檢測方法主要分為標準光驅檢測法和光驅改造檢測法。Lange等[3]將光驅激光頭置于暗場光學顯微鏡的頂部,使其改裝成為“光驅成像儀”，實現了檢測限達到單個分子水平的納米金顆粒標記銀染色后的免疫反應的檢測；Potyrailo等[4]從光驅電路板上提取光學頭光電探測器模擬信號，然后使用數據采集卡采集和LabVIEW編寫程序對光驅控制和成像從而實現了CD光盤表面的金屬離子的定量檢測；Harisha等[5]開發了一套具有溫度閉環控制、轉速控制的HIV疾病診斷設備并且特殊制作了半透射半反射的微流控生物光盤，再將標準DVD光驅置于這套設備中，增加光電探測器使其成為了激光掃描儀并用于血液細胞中CD4+離子的鑒別與計數，最小成像精度接近1 μm。上述幾種方法由于對標準光驅采取了過度改造，導致普通用戶無法使用光驅的原有功能，破壞了光驅的原始使用性。加拿大于化忠教授的課題組提出并開發了一種全新的基于標準光盤/光驅的數字化生物分子檢測技術[6-8]，該檢測方法充分利用了光盤技術的數據保護機制，使用標準光驅結合光盤質量診斷軟件的方式實現定量檢測。

藍光光盤(BD)是CD、DVD之后發展起來的一種具有高存儲容量的光盤格式。區別于CD和DVD的780 nm、650 nm讀取波長，藍光光盤的命名是由于它采用了更短的405 nm藍色激光和更高的數值孔徑來進行光盤的讀取與刻錄。藍光光盤更小的聚焦光斑對基于光驅的檢測技術而言，意味著更高的檢測通量和靈敏度[9]，基于此，本文研究了基于BD技術的高分辨成像檢測方法，通過水解反應成功地將惰性的BD表面轉化為有活性的生物基底，并使用C++、LabVIEW和MATLAB混合編程開發了一套完整的光驅成像檢測系統。并通過實驗驗證了該系統的可行性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：BD-ROM(25 GB BD-R，日本威寶公司)，藍光刻錄機(日本Plextor公司)，臺式計算機(Vostro 230s，美國戴爾公司)，數據采集卡(PCI8514，阿爾泰)。

試劑：磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、氫氧化鈉(NaOH)、氯化鈉(NaCl)、BSA(牛血清白蛋白)購買于 Aladdin(中國，上海)。AFB1-BSA(牛血清白蛋白包被黃曲霉素B1(Aflatoxin B1))、AFB1 抗體、AFB1 的標準試劑、檸檬酸、Tween 20(吐溫-20)、Gelatin(明膠)、NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)、EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)購于 Sigma(美國，圣路易斯)。甲醇(CH3OH)、對苯二酚、硝酸銀(AgNO3)購于科密歐(中國，天津)。疊氮化鈉(NaN3)購于索萊寶科技有限公司(中國，北京)。生物素標記試劑盒-氨基購于同仁化學研究所(日本)。納米金標記的鏈霉親和素(直徑為 1.4 nm)購于 Nanoprobes 公司(美國，紐約)。實驗用水為超純水(18.20 MΩ·cm)。

1.2 實驗方法

1.2.1 墨點陣列的制備與讀取

(1) 選擇表面干凈、無劃痕的空白BD-R光盤(威寶公司，Verbatim)并使用紫外臭氧清洗機(NANOSCAN)對BD-R光盤表面進行5～10 min活化處理。

(2) 根據需要使用光盤設計軟件EPSON Print CD進行圖案設計(在本實驗中，共設計了3種不同的打印圖案，分別是不同直徑點陣列、不同顏色的打印條帶陣列和不同灰度的打印條帶陣列)，并將打印參數中的“打印顏色校正”設置為“較亮(+3)”，以使出墨量最小，之后將打印機前置可拆卸托盤按鈕按下，然后將光盤數據面朝上放入打印托盤，開始打印。

(3) 光盤打印完成后，將光盤取出置于干燥箱內，在室溫下干燥20 min左右后，取出靜置一天以將表面墨汁干涸，防止在讀取過程中，光盤轉速太快而出現甩墨的情況。

1.2.2 AFB1免疫優化反應陣列的制備與讀取

(1) 選擇表面干凈的空白BD-R光盤，將光盤浸泡在濃度為0.1 M的NaOH溶液中1.5 h，溫度控制在55 ℃±1 ℃范圍內，隨后將光盤取出，用超純水清洗干凈光盤表面，用氮氣將光盤吹干。

(2) 將濃度為100 mM的EDC和45 mM的NHS(緩沖液是pH為6的PBS溶液,0.1 M的PBS緩沖溶液由87.7 mL的0.2 M NaH2PO4溶液和12.3 mL的Na2HPO4溶液混合并加超純水稀釋至200 mL配制)的活化液滴加于光盤表面的標記區域，活化4 h。

(3) 首先將 PDMS 微通道緊貼在光盤表面標記區域，然后在各通道的加樣孔注入濃度為100 μg/ml的AFB1-BSA 溶液并在對應的出樣孔使用真空泵抽吸使溶液充滿通道，之后靜置一夜(室溫下)，使 AFB1-BSA 充分固定在光盤表面，使用pH 7.4的緩沖液沖洗通道，注入緩沖液1(pH 7.4: 150 mM NaCl,0.8% BSA,0.1% gelatin,0.05% Tween 20,and 0.05% NaN3)，封閉 3 h，然后注入buffer 2 (pH 7.4: 150 mM NaCl,0.8% BSA,0.1% gelatin,0.05% Tween 20,0.05% NaN3)，封閉1 h，之后再用 10 mM PBS 緩沖液沖洗微通道。

(4) 將2 μL生物素標記的AFB1 抗體(濃度1～25 μg/ml)注入通道內反應1 h。

(5) 注入濃度為 1.6 μg/mL 的 Nanogold-Streptavidin 溶液(20 mM pH為7.4的PBS緩沖液，150 mM NaCl,0.1% BSA,and 0.05% NaN3)，室溫下反應 1 h。

(6) 揭下 PDMS 微通道后，先使用超純水將BD光盤表面沖洗干凈，再用氮氣吹干。

(7) 將新配制的濃度為48 mM的silver nitrate和 濃度為182 mM的hydroquinone按照 1∶1 比例均勻混合后鋪設到標記的反應區域，銀染6 min左右，整個銀染過程需保證在避光環境中操作。

(8) 用超純水沖洗光盤表面，并用氮氣吹干，最后將光盤放入光驅中，使用本文開發的光驅成像檢測系統完成生物光盤的讀取采集和成像分析。

2 結果與討論

2.1 光驅成像檢測系統的設計

基于標準藍光光盤/光驅的成像檢測系統由標準藍光光驅、數據采集卡、個人計算機和應用軟件四部分構成。采集信號由光驅中電路板接出，經BNC接口由數據采集卡采集。由于數據采集卡與主機之間PCI接口的需要，本系統使用了Dell 的Vostro 230s臺式計算機作為采集數據的接收、存儲與處理分析的平臺。應用軟件開發在Windows環境下完成，使用LabVIEW開發了系統UI和部分功能，C++編寫了光驅控制的動態鏈接庫，MATLAB完成了數據圖像處理的一些功能。通過動態鏈接庫和ActiveX技術將所有功能整合至同一LabVIEW工程，開發了一套完整的應用軟件。軟件整體工作流程圖和操作界面如圖1所示。

圖1 光驅成像系統工作流程圖和操作界面

2.2 光驅成像檢測的原理和系統可行性分析

本文所提出的基于標準藍光光盤/光驅成像檢測技術是根據BD光驅讀取光盤時激光頭的光學精確掃描原理，即BD光盤表面發生生物識別反應的位點(經金/銀納米粒子信號擴增后)會干擾讀取激光束對刻錄在光盤上的信息的正常讀取，光驅激光頭中光電二極管接收到的光束強度就會隨之降低，相應的幅值變化可以用于量化分析。同時，在讀取過程中激光頭呈螺旋線精確掃描光盤表面，相鄰螺旋線軌道間距可達0.32 μm。而利用該原理實現分子定量檢測的關鍵問題是建立掃描光盤的光學信號數據提取、處理與成像分析，得到待檢物濃度變化的關系。為此，在BD光盤表面打印了6條灰度不同的線段組成的陣列，如圖2所示。之后使用基于標準藍光光盤/光驅成像檢測系統對光盤進行測試。檢測結果表明，在光盤讀取至相應位置時，BD表面的陣列產生了6個幅度變化依次升高的峰，而這6個峰的峰值與打印線段一一對應，實驗結果證明了該方案的可行性。

圖2 BD表面打印線段陣列模擬檢測

2.3 基于標準藍光光盤/光驅成像檢測技術的檢測靈敏度與分辨率

實驗中使用的BD光盤表面顏色呈深色，打印的陣列圖案在燈光反射下方能看得清。因此，拍照對其上打印的檢測陣列的灰度分析變得不太容易實現。而由光驅成像檢測系統原理可知，這種精密聚焦掃描的成像方式可以解決這一問題。

為了驗證基于標準藍光光盤/光驅成像檢測技術的檢測靈敏度與分辨率，在BD表面打印12個不同尺寸的墨點陣列進行模擬實驗驗證。如圖3(a)所示，每個墨點陣列均為打印的2個直徑從100 μm 到600 μm的6×12個點的陣列，圖3(b)為打印BD光盤的光學圖片及使用基于標準藍光光盤/光驅成像檢測系統進行成像檢測的結果。從圖中可以看出，打印的點全部可以檢測到，因此使用基于標準藍光光盤/光驅成像檢測技術可以實現很高的靈敏度和檢測通量。

圖3 高檢測通量測試

2.4 BD表面AFB1優化反應的定量檢測

BD表面AFB1優化反應的定量檢測實驗反應后的BD光盤如圖4所示。

圖4 AFB1免疫優化反應陣列BD光盤

圖4 (a)中，標準樣品陣列共6個條帶，濃度分別為：1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、14 μg/mL、18 μg/mL。使用本文開發的光驅成像檢測系統成像結果如圖4(b)所示，光盤上的標準線和樣品陣列可以完整地檢測出來，且在偽色圖Color bar為hot的圖像中，可以直觀地看到標準線中6個條帶的亮度值有逐漸升高的趨勢。對生成的圖像分別使用“檢測分析”和“附加模塊”進行分析，結果如圖5所示。

圖5(a)為使用“附加模塊”對所成圖像的8位灰度圖進行線像素值測試，直觀地從數值上分析，6個反應條帶的像素峰值分別約為92、110、127、162、195、223。為了進一步更精確地檢測，使用“圖像分析”對所成圖像的16位tif格式圖進行全圖像分析，結果如圖5(b)所示。相較于圖5(a)中線像素值測試，圖5(b)則對反應條帶內的所有像素值取均值，避免了可能存在的條帶灰度不均勻，使檢測結果更加準確。圖5(c)為(b)中標準線區域的放大圖，可以看到6個反應條帶的像素均值分別為21 937.18、25 487.98、30 530.92、34 678.58、39 015.89、44 166.13。

為了通過標準線得出檢測待測樣品的濃度，首先由圖5(b)得出3個待測樣品條帶的像素均值分別為39 563.79、31 793.08、28 304.67，然后將標準線中每個條帶對應的生物素標記的AFB1 抗體濃度和像素均值分別輸入標準樣品濃度和標準像素值中，將待測樣品條帶的像素均值輸入標準像素值中，通過曲線擬合計算得出標準品曲線方程，繼而求出3個待測樣品的濃度分別為：13.081 μg/mL、5.836 μg/mL、3.496 μg/mL，如圖6所示。

圖5 AFB1免疫優化反應陣列BD光盤所成圖像的檢測分析

圖6 AFB1免疫優化反應陣列BD光盤檢測結果

3 結束語

本文提出了基于藍光技術的數字化分子檢測方案，使用C++、LabVIEW和MATLAB混合編程技術，對基于標準藍光光盤/光驅的成像檢測系統進行了研究、設計與實現，使標準藍光光驅經過簡單的光學信號提取就可以成為專業化的POCT診斷設備。通過對光盤表面微尺度墨點陣列的分析，表明了藍光檢測系統的橫向分辨率小于藍光光盤表面的光斑直徑(138 μm)，可以檢測出直徑小于100 μm的墨點；通過對AFB1優化反應的分析，得出其可以作為生物反應灰度學分析測試的平臺，應用于醫療診斷、環境監測以及食品安全等領域。

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