小鼠骨髓間充質干細胞自噬與衰老的關系

孫志敏，張錚，文童，張麗娟，楊超，柳彥君，胡桃紅

（1.錦州醫科大學火箭軍總醫院研究生培養基地，遼寧 錦州 121000；2.中國人民解放軍火箭軍總醫院 心血管內科，北京 100088；3.中國人民解放軍火箭軍總醫院輸血科，北京 100088）

近年來研究發現，骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs）具有自我更新和多向分化的潛能，也具有組織修復和抑制自身免疫的潛在可能性，是自身干細胞治療理想的種子細胞[1-2]。而老年患者自身的BM-MSCs也處于衰老狀態下，移植入組織后活力及增殖能力下降，嚴重限制了臨床療效。因此，明確BM-MSCs衰老損傷的機制，是提高自體干細胞療效的關鍵問題。衰老是生物體內損傷的分子﹑細胞﹑組織不斷積聚，導致生物體功能減退和細胞正常生理功能改變的過程[3]。前期研究證實，自噬通過清除細胞內受損的細胞器和錯誤折疊或聚集的蛋白質等，來維持細胞功能，并參與細胞衰老過程[4]。本實驗探討衰老細胞中自噬水平的變化及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

C57/6健康小鼠（第四軍醫大學動物實驗中心），胎牛血清﹑α-DMEM培養基購自美國Hyclone公司，淋巴細胞分離液（上海化學試劑二廠），胰蛋白酶﹑LC3抗體購自美國Sigma公司，鼠抗p62﹑Beclin-1抗體﹑β-actin抗體購自英國Abcam公司，p-Akt抗體（美國CST公司），血管內皮生長因子（vascular endothe growth factor, VEGF）ELISA試劑盒﹑堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）ELISA試劑盒﹑胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor, IGF-1）ELISA試劑盒﹑肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor, HGF）ELISA試劑盒購自美國R&D公司，GFP-LC3質粒（美國Invivogen公司），X-treme GENEHP DNA轉染試劑﹑脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（Terminal deoxynucleotidly transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒購自美國羅氏公司，Akt活性檢測試劑盒（美國Bio Vision公司），酶聯免疫檢測儀（美國BIO-TEK公司），BX50型顯微鏡（日本Olympus公司），Nikon A1 激光共聚焦顯微鏡（日本尼康公司），流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠BM-MSCs的分離和培養 年輕小鼠（8周齡）和老年小鼠（18個月齡）麻醉脫頸椎處死后，在無菌狀態下分離其股骨和脛骨。用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）沖出骨髓，比重1.077的淋巴細胞分離液作梯度離心（2 000 r/min離心30min），收集單個核細胞，PBS洗滌，將含10%胎牛血清的α-DMEM培養基放入培養皿，在5%二氧化碳CO2﹑37℃孵箱中培養。換液1次/3 d。待細胞融合接近80%，用0.25%胰蛋白酶（0.1 ml/cm2）消化2～3min，將細胞以1×104個/ml傳代。采用第3代細胞進行實驗。

1.2.2 流式細胞儀 取第3代小鼠BM-MSCs，胰酶消化3min，離心后PBS洗滌重懸2次，細胞以1.5×106個/ml接種于4個1.5 ml EP管中，分別加入抗小鼠CD31﹑CD45﹑CD90﹑CD29，置于4℃冰箱，避光孵育30min，PBS洗滌后用流式細胞儀檢測﹑分析。

1.2.3 TUNEL細胞凋亡檢測 在預置玻片的24孔板上按3×104個/ml培養兩組BM-MSCs，PBS清洗。按分組情況，用含10%胎牛血清的α-DMEM培養基培養24 h，加終端轉移酶和熒光素標記的dUTP，37℃孵育45min。PBS洗滌細胞3次后，加入DAPI染色識別細胞核，PBS洗滌細胞3次后，用Nikon A1激光共聚焦顯微鏡觀察染色結果。TUNEL標記陽性（綠色熒光）的細胞為凋亡細胞。凋亡細胞的百分比作為凋亡指數。所有操作在暗室中完成。

1.2.4 ELISA 培養兩組 BM-MSCs 6×106個 /ml，PBS清洗。按分組情況，用含10%胎牛血清的α-DMEM培養基培養24 h，提取細胞上清液，0.22μm濾器抽濾，按照VEGF﹑bFGF﹑IGF-1﹑HGF蛋白ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 Western blot檢測 按分組情況，培養BMMSCs 5×106個/ml。4℃條件下冰上裂解細胞5min。裂解液包含TBS﹑Triton-X100破膜（1 mm，美國Sigma公司）﹑4%丙三醇﹑二乙胺四乙酸（1 mm，美國Sigma公司）和蛋白酶抑制劑PMSF（1 mm，美國Roche Molecular Biochemicals公司），12 000 r/min離心10min后提取蛋白液。兩組分別取50μg蛋白樣品，12% SDS-PAGE凝膠電泳90min﹑120 V，轉至硝酸纖維素薄膜300 mA﹑40min，蛋白膜在封閉液中封閉60min。分別添加兔抗鼠LC-3抗體（1∶500）﹑Akt抗體（1∶500），p-Akt抗體（1∶500）﹑β-actin抗體（1∶2000）抗體，4℃孵育過夜。PBS洗膜，用辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（1∶200），室溫孵育90min，洗膜，采用ECL試劑按步驟檢測蛋白表達，Image-Pro Plus 6.0.1軟件分析各條帶吸光度值作定量分析。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠BM-MSCs表型比較

流式細胞術檢測顯示，年輕組和老年組BMMSCs均為CD31﹑CD45陰性，而CD90和CD29表達陽性，提示兩組BM-MSCs細胞表型無明顯差異。見圖 1﹑2。

2.2 兩組細胞凋亡率比較

年輕組和老年組BM-MSCs經TUNEL和DAPI染色的免疫熒光檢測圖見圖3。年輕組BM-MSCs細胞凋 亡率為（12.583±1.212）%，老 年組為（37.831±3.432）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=9.128，P=0.000），老年組BM-MSCs細胞凋亡率高于年輕組（見圖4）。

2.3 BM-MSCs分泌蛋白VEGF、bFGF、IGF-1、HGF水平

年 輕 組 BM-MSCs分 泌 VEGF﹑bFGF﹑IGF-1﹑HGF 分 別 為（424.545±88.735）﹑（14.587±4.413）﹑（36.334±2.952）和（15.335±5.915）pg/ml，老年組BM-MSCs分泌 VEGF﹑bFGF﹑IGF-1﹑HGF分別為（335.737±65.574）﹑（8.132±2.248）﹑（28.764±4.252）和（9.723±1.835）pg/ml，經t檢驗，差異有統計學意義（t=2.673﹑4.423﹑3.273和2.867，P=0.014﹑0.000﹑0.014和0.010），老年組分泌蛋白水平均低于年輕組。見圖5。

2.4 BM-MSCs自噬相關蛋白LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5、p62的表達

年輕組小鼠BM-MSCs的LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ﹑Bclin 1﹑ATG12-5﹑p62蛋 白 相 對 表 達 量 分 別為（0.68±0.13）﹑（1.16±0.12）﹑（1.12±0.12） 和（1.01±0.11），老年組小鼠 BM-MSCs的 LC3-Ⅰ /LC3-Ⅱ﹑Bclin 1﹑ATG12-5﹑p62蛋白相對表達量分別 為（0.32±0.02）﹑（0.41±0.09）﹑（0.30±0.04） 和（2.67±0.31），經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.985﹑9.315﹑11.38 和 8.794，P=0.007﹑0.007﹑0.003 和 0.001），老年組自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ﹑Bclin1﹑ATG12-5表達水平低于年輕組，p62表達水平高于年輕組。見圖6﹑7。

圖1 第3周兩組小鼠BM-MSCs細胞形態 （光鏡）

圖2 兩組小鼠BM-MSCs細胞表型

圖3 BM-MSCs自噬相關免疫熒光

2.5 BM-MSCs自噬調節通路蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR的表達

Western blot檢測結果表明，年輕組與老年組BM-MSCs中Akt和mTOR無差異，而老年組p-Akt和p-mTOR蛋白表達水平高于年輕組（見圖8）。年輕組和老年組的p-Akt/Akt蛋白相對表達量分別（0.25±0.05）和（0.51±0.09），經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.647，P=0.000），老年組高于年輕組。年輕組和老年組的p-mTOR/mTOR蛋白相對表達量分別（0.14±0.02）和（0.27±0.03），經t檢驗，差異有統計學意義（t=8.062，P=0.000），老年組高于年輕組（見圖9）。

圖4 兩組小鼠BM-MSCs細胞凋亡率比較 （±s）

圖5 兩組小鼠BM-MSCs分泌蛋白VEGF、bFGF、IGF-1、HGF水平比較 （±s）

圖6 BM-MSCs自噬相關蛋白的表達

圖7 兩組小鼠BM-MSCs自噬相關蛋白表達水平比較 （±s）

圖8 BM-MSCs自噬調節通路蛋白的表達

圖9 兩組小鼠自噬調節通路蛋白表達水平比較 （±s）

3 討論

缺血性心臟病是臨床上死亡率較高的一種疾病[5]。自體干細胞移植是一種新的治療缺血性心臟病的方法[6]，但是干細胞移植入組織后活力及增殖能力下降是治療中遇到的最主要問題。BM-MSCs具有較強的多向分化和自我更新潛能[7]，可以通過旁分泌作用改善梗死的心肌組織[8]，是治療缺血性心臟病的一種理想種子干細胞。缺血性心臟病多見于老年患者，用于自體移植治療的BM-MSCs同樣處于衰老狀態。本實驗前期研究證實，衰老的BM-MSCs移植入心肌組織后，活力及增殖能力明顯下降，療效不理想[9]。因此，探究BM-MSCs衰老過程中活力及增殖能力下降的機制，是提高其療效的關鍵。

自噬是一種高度保守的生理過程，廣泛存在于大部分真核細胞中[10]。自噬在細胞中具有雙刃劍的作用[11]。在生理條件下，細胞自噬水平較低，通過清除細胞內功能受損的細胞器和錯誤折疊的蛋白質來維持細胞的正常生理功能。但是在應激條件下，如細胞能量缺失﹑缺血等，細胞自噬水平明顯增高，過度降解細胞自身成分，從而導致細胞損傷[12]。在細胞衰老的過程中，自噬也發揮一定作用。自噬的過程復雜，可分為啟動﹑形成和降解再利用3部分。啟動階段是由mTOR相關靶點誘導，在自噬相關基因（ATG）蛋白的協同下，形成弧形凹陷的雙層膜結構，即自噬前體。然后自噬前體識別并包裹細胞內功能受損的細胞器和錯誤折疊的蛋白質，雙層膜結構逐漸延伸直至融合，形成完全包裹細胞內物質的自噬體。自噬體形成后，與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，自噬體內層膜及細胞內物質最終被降解，降解產物進入胞漿進行再利用[13-15]。LC-3和Beclin 1是自噬發生和形成過程中重要的自噬相關分子，Beclin 1能夠聚集自噬體，并且在自噬的過程中起正調控作用[16]。在動物細胞自噬的過程中，p62是一種普遍表達的蛋白質，可與前自噬體膜LC-3相互作用，并在Atg12-5的參與下形成自噬體，自噬體在溶酶體的作用下降解，因此p62的水平與自噬呈負相關[17-19]。本研究中利用Western blot檢測自噬相關的蛋白，結果提示衰老BM-MSCs中LC3-Ⅰ﹑LC3-Ⅱ﹑Beclin 1﹑ATG12-5表達減少，而p62表達增多。提示衰老BM-MSCs自噬水平下調，與前期研究結果一致。

衰老是生物體內受損和有缺陷的細胞不斷進行積累，造成生物體功能的衰退和器官老化的過程[5]。本實驗TUNEL結果提示，老年組細胞凋亡較年輕組增加，提示衰老可以增加BM-MSCs的細胞凋亡。前期研究結果表明，在整個衰老過程中，自噬相關蛋白及自噬活性均有所下降，提示自噬的水平可能與衰老損傷有關。BM-MSCs可以分泌多種細胞因子，如VEGF﹑bFGF﹑IGF-1﹑HGF[20]，但是衰老對BMMSCs旁分泌作用的影響及機制仍不是很明確。本實驗通過ELISA檢測BM-MSCs分泌細胞因子的能力，結果發現老年組BM-MSCs中VEGF﹑bFGF﹑IGF-1﹑HFG的分泌量較年輕組下降，提示衰老BM-MSCs旁分泌功能受損。上述結果說明，在衰老過程中，BMMSCs凋亡增加，自噬水平及旁分泌功能下降。

許多研究指出，自噬過程調節的一條重要途徑是Akt-mTOR途徑[21]。其中Akt又稱為蛋白激酶B，是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶。mTOR是一類大分子蛋白，也是調控細胞生長﹑增殖及自噬的重要信號通路。mTOR有mTORC1和mTORC2 2種復合物形式，其中調節細胞增殖﹑凋亡及自噬等的主要是mTORC1。在細胞因子的作用下，Akt活化后將信號下傳至mTOR，活化后的mTOR激活其下游的相關因子，促進細胞蛋白質合成﹑增殖及生長，加速細胞代謝，抑制細胞的自噬作用[14-15]。在本實驗中衰老組BMMSCs中p-Akt﹑Akt﹑p-mTOR﹑mTOR表達減少，細胞凋亡增加。

通過實驗筆者對自噬和衰老的分子機制及相互作用有進一步的認識。實驗結果表明，老年組BMMSCs細胞凋亡增加，分泌蛋白功能減弱，自噬及自噬相關蛋白水平下降，p-Akt﹑Akt﹑p-mTOR﹑mTOR蛋白表達增加。衰老是細胞自噬增加的一個影響因素，自噬增加又能夠引起衰老。

參 考 文 獻：

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