修飾殼聚糖包裹的豬IL-2和IL-4/6共表達對小鼠免疫效應的影響

肖永樂 ，楊璐一 *，梁歌 ，萬小平 ，羅公民 ，呂學斌 ，王澤洲 ，高榮 **

（1.四川大學生命科學學院，生物資源與生態環境教育部重點實驗室，動物疾病防控與食品安全重點實驗室，四川 成都 610064；2.四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066；3.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041）

近年來，越來越多的細胞因子被用作疫苗的分子佐劑[1]，然其成本高，半衰期短，限制了細胞因子的大規模使用，亟需開發安全和性價比高的免疫調節劑來增強動物的免疫能力。復雜的細胞因子網絡限制了單個細胞因子基因在體內的表達活性，加之單基因的生物學活性通常達不到足夠的免疫增強效果，為了克服這個限制，我們設計了融合的多個細胞因子基因，使之能夠在動物細胞中共表達，加強調節效應，增強動物對感染性疾病的免疫保護能力。這類細胞因子中最常使用的就是白介素分子[2-4]，本研究中我們用2A自剪切短肽連接豬IL-2和IL-4/6，探究其在體外和小鼠體內的免疫協同效應。

1 材料和方法

1.1 重組質粒 真核分泌型表達質粒VR1020，插入融合豬IL-4和IL-6的VRIL4/6以及插入豬IL-2的VRIL2均由本單位實驗室構建和保存。

1.2 修飾殼聚糖包裹納米顆粒的制備及檢測 用離子交聯法制備質粒DNA殼聚糖納米顆粒，按文獻報道的方法[5]先制備殼聚糖聚乙二醇-聚乙烯亞胺修飾分子（CPP），與質粒按質量比為30∶1的比例在50～55℃水浴磁力攪拌下，將質粒緩慢滴加至材料溶液中，混合均勻，恒溫10min，最終得到包裹好的4種納米顆粒：VRIL4/6-2-CPP、VRIL4/6-CPP、VRIL2-CPP、VR1020-CPP。

將納米顆粒樣品進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳。取1mL納米顆粒，用Zetasizer 3000 HS/IHPL納米粒度分析儀測定粒徑及Zeta電位。

1.3 重組質粒在HEK293細胞中的表達 6孔板中培養HEK293細胞至有80%貼壁時轉染4種納米顆粒，每孔緩慢滴加50μL納米顆粒，分別于24h、48h和72h收集上清用于檢測生物學活性。

1.4 重組質粒的生物學活性檢測 用文獻報道的方法制備豬淋巴母細胞，96孔板中每孔加入50 μL靶細胞和50μL轉染上清液。每個樣品設3個重復孔，并設對照孔，置于細胞培養箱中培養48h，然后每孔加入10μL CCK8輕輕吹勻，繼續培養2h，用Bio-Reader3550檢測每孔OD450（參照OD630）。

1.5 重組質粒在小鼠體內的生物學效應 將40只21日齡（18～22g）健康昆明雌鼠隨機分成4組，每組10只，見表1。每只小鼠注射含有100μg重組質粒的納米顆粒，注射后每周稱重并采血。用流式細胞儀測量外周血中CD4+和CD8+T淋巴細胞的變化；用ELISA檢測血清中的IgG、和IgG1水平；用熒光定量PCR檢測血液中免疫相關基因的表達情況。

表1 小鼠分組情況

2 結果

2.1 納米顆粒的凝膠阻滯實驗、粒徑及Zeta電位 CPP包裹4種質粒形成的納米顆粒，通過0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現5種納米顆?；蛳蛘龢O方向跑，或被阻滯在點樣孔中，說明質粒和包裹材料成功地結合在了一起，形成納米顆粒，并且納米顆粒分子粒徑較小。

4種納米顆粒的粒徑及Zeta電位見表2。從表2可見，所有包裹納米顆粒的平均粒徑在98～154nm之間，Zeta電位在+24.5～+44.7mV之間，說明轉染效率較好。

表2 納米顆粒的粒徑和電位

2.2 重組質粒的體外生物學活性 通過CCK8檢測細胞成活結果（圖1），可見豬淋巴母細胞明顯增殖，VRIL4/6-2-CPP、VRIL4/6-CPP和 VRIL2-CPP均較對照VR1020-CPP組增殖明顯。說明實驗質粒用CPP包裹后均能表現出高效的生物學活性，顯著刺激豬淋巴細胞增殖（P＜0.05），且 VRIL4/6-2-CPP共表達實驗組的效果最佳。

圖1 淋巴母細胞增殖情況

2.3 重組質粒在小鼠體內的生物學效應

2.3.1 免疫基因表達定量分析 從免疫相關基因表達水平的定量分析結果（圖2）可以看出，實驗組IL-1、IL-2、IL-4三種基因的表達量顯著高于對照組（P＜0.05）。IL-1和IL-2基因的表達量在7～28d內持續增高并達到峰值，之后逐漸下降，并且VRIL4/6-2-CPP組的表達量略高；IL-4基因的表達量在7～21 d內持續增高并達到峰值，之后逐漸下降；21d之后可以觀察到VRIL4/6-2-CPP組的表達量逐漸高于VRIL4/6-CPP 和 VRIL2-CPP組（P＜0.05）。

2.3.2 CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群檢測 整體來看（圖3），在免疫后21 d內，實驗組小鼠血液中的CD4+和CD8+T淋巴細胞含量均較對照組顯著升高（P＜0.05）。

2.3.3 血清IgG、IgG1含量測定 如圖4所示，實驗組小鼠血清中的IgG、IgG1水平均較對照組顯著增加（P＜0.05）。IgG含量在0～35d內持續增加，IgG1含量保持平穩，變化不大。

2.3.4 小鼠體重變化 整體來看，注射后0～35d，實驗組小鼠的生長速度明顯高于對照組小鼠（P＜0.05），見圖5。

圖2 免疫相關基因表達水平的定量分析

圖3 小鼠CD4+和CD8+T淋巴細胞的比例變化

圖4 實驗小鼠血清IgG、IgG1含量變化

圖5 小鼠體重變化

3 討論

本研究中我們使用2A自剪切短肽連接豬IL-4/6和IL-2基因，獲得了一種新型有效的免疫調節分子。2A自剪切技術可使多個基因使用同一個啟動子，實現在同一載體中等量表達[6-7]，因此我們在本研究中利用它共表達了3個關鍵的細胞因子基因，從而增強豬對感染性疾病的免疫能力。體外淋巴母細胞增殖實驗證實了融合的VRIL4/6-2可在真核細胞中成功表達出IL-4/6和IL-2，且融合的IL-4/6和IL-2比單獨的IL-4/6或IL-2更能促進細胞增殖。整個實驗期間，小鼠注射部位無局部炎癥發生，在35d的觀察期內，實驗組小鼠也檢測不到系統性的免疫反應癥狀。

本研究還發現，實驗組血清的IgG含量明顯增加，且注射VRIL4/6-2的小鼠效果最佳，CD4和CD8分子、IL-2和IL-4基因的表達量也都在注射后不同時間段有所升高。表明注射VRIL4/6-2可加強小鼠的體液免疫、細胞免疫和免疫調節能力。同時，還觀察到注射VRIL4/6-2的小鼠比其他組生長更快，與增強免疫的結果保持一致。這些結果有力地證實了CPP包裹的VRIL4/6-2納米顆?？捎行г鰪娦∈蟮纳L能力和免疫能力。

本研究證實了VRIL4/6-2能有效增強動物的體液免疫和細胞免疫，可開發成安全有效的免疫增強劑。

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