丙烯腈暴露對大鼠腦組織損傷及iNOS/p38 MAPK信號通路關鍵蛋白表達的影響

羅波艷, 張瑞萍, 王珂, 魏琳顏, 趙粉線, 薛紅麗, 李芝蘭,*

1. 蘭州大學公共衛生學院, 蘭州 730000 2. 寶雞市疾病預防控制中心，寶雞 721006

丙烯腈(acrylonitrile，ACN)是一種被廣泛用于工業、高分子材料及生活日用品等方面的生產原料。國際癌癥組織(IARC)已于1999年將ACN的致癌性歸為2B類，即為“可能致癌物”[1]。大量研究表明，ACN可對機體多個系統造成損傷，其中神經系統毒性是ACN毒作用出現最早、最為突出的毒性表現之一[2-4]。

作為細胞間信號轉導的一種重要物質，一氧化氮(nitric oxide，NO)可參與機體各種生理、病理過程。有研究報道，NO代謝水平變化與帕金森等神經退行性疾病的發生相關[5-6]，且過量的NO可使神經系統誘發癲癇，引發腦損傷和記憶缺損等[7]。體內NO含量受一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)水平的調控。NOS又包括內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、神經型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)和誘導型/免疫型一氧化氮合酶(inducible or immunological nitric oxide synthase，iNOS)3種，其中iNOS主要作為神經遞質與神經調質，參與信息傳遞[8]，eNOS和nNOS負責維持體內正常生理水平的NO生成[9]。當機體受到炎癥、免疫微生物等刺激時，會激活iNOS在巨噬細胞和中性粒細胞等細胞上的表達，繼而誘導機體產生和釋放大量NO[10]，導致組織損傷和發生細胞凋亡[11]。因此，iNOS/NO含量的高低對神經系統的功能正常與否起著重要的作用。此外，p38 MAPK信號通路在MAPK信號通路中扮演著非常重要的角色，其在細胞凋亡、細胞因子產生、轉錄調節等機制中發揮著重要作用[12]。

有研究結果顯示，N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)可以干預ACN對神經細胞誘導的損傷[13]。因此，本研究擬用不同劑量ACN對雄性SD大鼠進行灌胃染毒，檢測腦組織NO含量及iNOS和p38 MAPK蛋白表達，同時設立NAC干預組，觀察NAC對ACN產生的大鼠腦組織毒性作用的干預作用，以期為ACN誘導的大鼠神經系統毒性機制深入研究提供依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物及分組

選取由甘肅中醫藥大學醫學實驗動物中心提供的50只SPF級成年健康雄性SD大鼠(動物合格證號為SCXK(甘)2011-0001)，體重250～300 g，全程飼養于甘肅中醫藥大學醫學動物實驗中心(設施合格證號：SYXK(甘)2011-0001)。實驗室晝夜交替照明，溫度為(22±1) ℃，濕度為50%。大鼠可自由攝食飲水。適應性飼養一周后，將大鼠隨機分為5組，分別以低(12.5 mg·kg-1)、中(25.0 mg·kg-1)、高(50.0 mg·kg-1)劑量ACN對大鼠進行灌胃染毒，對照組大鼠用玉米油進行灌胃，另設NAC干預組，即先用300.0 mg·kg-1NAC給大鼠進行灌胃，30 min后再用50.0 mg·kg-1ACN對大鼠灌胃染毒，1次·天-1，6天·周-1，共連續灌胃染毒13周。末次染毒結束后，次日心臟采血后處死大鼠。

1.2 藥物及試劑

ACN(純度>99%)購買于天津四通化工廠，NAC購買于美國Amersco公司，NO和NOS試劑盒購買于南京建成生物工程研究所，BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)購買于上海碧云天生物有限公司，iNOS購買于武漢Proteintech公司，eNOS、nNOS購買于美國SAB公司。β-Tublin、HRP標記山羊抗兔/抗鼠購買于武漢伊萊瑞特公司，p-p38和p38購買于美國CST公司。低溫高速離心機(美國BECKMAN COULTER公司)，可見光分光光度計(上海精科有限公司)，酶標儀(美國Bio Tek公司)，電泳、轉膜和凝膠成像曝光儀(美國BIO-RAD公司)。

1.3 臟器系數測定

末次染毒結束后，次日對大鼠進行稱重，測量3次，求取大鼠的平均體重值。心臟采血后處死大鼠，將腦組織置于盛有0.86%生理鹽水的玻璃平皿中進行沖洗，干凈后用濾紙拭干，稱量3次，求取大鼠的腦組織平均濕重。用腦組織平均濕重和大鼠平均體重計算臟器系數(臟器系數(%)=臟器濕重(g)/ 體重(g)×100%) 。

1.4 NO含量及總NOS水平的測定

嚴格按照南京建成NO和總NOS測定試劑盒說明書的檢測要求，對腦組織中NO含量和總NOS水平進行檢測。并用碧云天BCA蛋白濃度測定法對大鼠腦組織蛋白含量進行定量檢測。

1.5 iNOS、eNOS、nNOS和p38、p-p38蛋白Western blot測定

從-80 ℃冰箱取出凍存的大鼠腦組織，按腦濕重(mg)與RIPA體積(μL)比為1:10的比例加入適量的高效RIPA裂解液，并按RIPA體積與PMSF體積比為100:1準確吸取PMSF，在冰水浴中對其進行充分研磨，然后置于EP管中予以標記。檢測磷酸化蛋白時，在研磨前按磷酸酶抑制劑體積與RIPA裂解液體積比為1:100的比例，準確加入磷酸酶抑制劑。以4 ℃、12 000 g·min-1對腦勻漿進行離心，離心15 min。吸取上清，分裝20 μL上清液用于BCA法測定蛋白含量，剩余上清液按每管100 μL分裝至EP管，加入適量的RIPA裂解液和5×上樣緩沖液，封口、標記后將EP管置于沸水中持續煮沸5 min，使腦組織蛋白樣品充分變性。然后按每條泳道蛋白含量為60μg進行SDS-PAGE電泳，根據彩虹蛋白Marker標識的位置，將凝膠蛋白轉移到PVDF膜上，封閉2 h，然后分別加入iNOS(兔抗，1：400)、eNOS(鼠抗，1:500)、nNOS(兔抗，1:1 000)、β-Tublin(兔抗，1:1 000)、p38(鼠抗，1:1 000)、p-p38(兔抗，1：500)，室溫孵育過夜，然后選擇對應的HRP標記的抗兔/抗鼠二抗，孵育2 h。最后加入適量ECL發光液，用凝膠成像儀進行曝光，保存條帶。采用Image J圖像分析軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析。

1.6 統計分析

2 結果(Results)

2.1 ACN對大鼠體重和腦組織濕重及臟器系數的影響

從染毒第6周開始，觀察到ACN各劑量組大鼠開始出現躁動、易激怒、輕度流涎等表現。單因素方差分析結果顯示，與對照組比較，高劑量組大鼠腦濕重顯著降低(P<0.05)。各劑量組大鼠體重與對照組相比較均升高，差異均無統計學意義(F=1.847，P=0.159)。隨著ACN染毒劑量增加，大鼠腦臟器系數逐漸降低(F=3.427，P=0.027)，且ACN各劑量組腦臟器系數均顯著低于對照組(P<0.05)。經NAC干預后，NAC組大鼠腦濕重、體重及臟器系數與高劑量組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。結果詳見表1。

2.2 ACN對大鼠腦組織NO含量和總NOS水平的影響

隨著ACN染毒劑量增加，大鼠腦組織NO含量和總NOS活力均不斷上升(F=8.528，P=0.000；F=3.422，P=0.028)。實驗結果顯示，高劑量組大鼠腦組織NO含量顯著高于對照組和低劑量組(P<0.05)。與對照組相比，ACN各劑量組大鼠腦組織總NOS活力均顯著升高(P<0.05)。經NAC干預后，與NAC組相比，高劑量組大鼠腦組織NO含量降低，總NOS水平升高，但其差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表1 丙烯腈(ACN)慢性染毒對大鼠腦組織、體重及腦臟器系數的影響Table 1 Effects of the chronic exposure of acrylonitrile (ACN) on brain tissues, body weights and the relative organ weights of the brain tissues in rats (n=5,

注：與對照組比較，*P<0.05; NAC為N-乙酰半胱氨酸。

Note: Compared with control group,*P<0.05; NAC stands for N-acetylcysteine.

2.3 ACN對iNOS、nNOS和eNOS蛋白表達水平的影響

Western blot結果顯示，與對照組比較，高劑量組大鼠腦組織iNOS蛋白和nNOS蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，eNOS蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。經NAC干預后，與高劑量組比較，NAC組大鼠腦iNOS蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，eNOS蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，nNOS蛋白表達水平升高(P>0.05)。結果詳見表3和圖1-A。

2.4 ACN對大鼠腦組織p38蛋白及其磷酸化蛋白的表達水平的影響

Western blot結果顯示，與對照組比較，高劑量組大鼠腦組織p-p38蛋白和p38蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，且p-p38/p38比值也顯著升高(P<0.05)。經NAC干預后，與高劑量組比較，NAC組大鼠腦組織p-p38和p38蛋白表達水平及p-p38/p38比值均顯著降低(P<0.05)。結果詳見表4、圖1-B。

表2 ACN慢性染毒對大鼠腦組織NO含量和總NOS活力的影響Table 2 Effects of the chronic exposure of acrylonitrile (ACN) on the contents of NO and the activities of total nitric oxide synthase (tNOS) in rats brain tissues

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note: Compared with control group,*P<0.05.

表3 ACN慢性染毒對大鼠腦組織NOS各亞型蛋白表達水平的影響Table 3 Effects of the chronic exposure of ACN on the protein expression level of three subtypes of NOS in rats brain tissues

注：與對照組比較，*P<0.05；與NAC組比較，#P<0.05。

Note: Compared with control group,*P<0.05; compared with NAC group,#P<0.05.

表4 ACN慢性染毒對大鼠腦組織p38蛋白及其磷酸化蛋白表達水平的影響Table 4 Effects of the chronic exposure of ACN on the protein expression level of p38 and p-p38 proteins in rats brain tissues

注：與對照組比較，*P<0.05；與NAC組比較，#P<0.05。

Note: Compared with control group,*P<0.05; compared with NAC group,#P<0.05.

圖1 ACN慢性染毒對大鼠腦組織NOS亞型蛋白及p38、p-p38蛋白變化的免疫印跡分析Fig. 1 Effects of the chronic exposure of ACN on the immunoblotting analysis of change of three subtypes of NOS, p38 and p-p38 proteins in rats brain tissues

3 討論(Discussion)

臟器系數不僅可以反映化學毒物對機體的亞慢性毒性效應以及對臟器的綜合毒性，而且可提供尋找毒物作用的靶器官的線索，對評價外源化學物的毒性具有靈敏性、有效性、經濟性[14]。本實驗中，ACN低、中、高劑量組大鼠腦臟器系數均顯著低于對照組，說明ACN對大鼠腦組織產生了慢性毒作用，這可能與腦組織是ACN毒作用的靶器官有關。有研究認為機體組織臟器系數降低，提示該組織可能出現了臟器萎縮、退行性變化[15]。本研究結果提示ACN灌胃染毒13周對大鼠神經系統產生了慢性毒作用，腦組織出現了萎縮和退行性變化。

NO是一種極不穩定的生物自由基，可快速通過生物膜進行擴散。雖然NO對神經系統功能的維持是必需的，其在突觸可塑性、神經調節和其他生理作用中也是不可替代的，對神經系統具有保護作用，但NO含量升高，會與超氧陰離子結合，形成高活性和高毒性的過氧化亞硝酸鹽(ONOO-)[16]，引起氧化應激和細胞損傷[17]，加之ONOO-不僅是一種強有力的酪氨酸硝化劑[18]，可能會導致抗氧化酶的亞硝基化[19]，而且還是NO的主要毒作用形式[20]，ONOO-可與H+形成ONOOH，繼而分解產生的羥基自由基(·OH)可進一步通過損傷線粒體電子傳遞系統，對特定組織造成一定的損傷[8]。在本研究中，ACN高劑量組大鼠腦組織nNOS和iNOS蛋白表達水平顯著高于對照組，eNOS蛋白表達水平顯著低于對照組。同時隨著ACN染毒劑量增加，大鼠腦組織tNOS水平和NO含量也均不斷升高。說明ACN可以誘導大鼠腦組織nNOS和eNOS蛋白表達水平改變，并刺激炎性細胞開始釋放iNOS，使iNOS水平升高，繼而使tNOS水平升高，引起NO含量增加，導致腦組織產生的ONOO-生成增加，最終引起腦組織發生氧化應激和細胞損傷。NAC是氨基酸L-半胱氨酸和GSH的乙酰化前體物質，可以對抗氧化作用和氧化代謝過程。對NAC開展的動物實驗研究和人群研究均表明它可以通過減少細胞外胱氨酸到半胱氨酸的轉化，或者可作為一種細胞內的巰基來源，使其成為一種強大的抗氧化劑[21]。此外，它還可以通過增強谷胱甘肽-S-轉移酶的活性，加之其自身也是一個強大的親核體，可以清除體內大量的自由基[22]。與高劑量組比較，NAC組大鼠腦組織tNOS水平降低，其中iNOS蛋白表達水平顯著降低，eNOS表達水平顯著升高，nNOS蛋白表達水平降低，表明NAC可以干預ACN引起的大鼠腦組織炎性細胞釋放iNOS，使iNOS水平降低，進而使腦組織tNOS水平降低，提示NAC可以通過降低ACN染毒大鼠腦組織ONOO-、·OH等氧化物質的水平來介導iNOS等蛋白表達水平的改變。但NAC組大鼠腦組織中NO含量與高劑量組比較升高，這可能是由于ACN染毒可引起大鼠腦組織ONOO-、·OH等自由基大量生成，加上NO本身也是一種自由基，導致300.0 mg·kg-1NAC不能完全對抗50.0 mg·kg-1ACN引起的腦組織損傷。

p38 MAPK信號通路是MAPKs家族中重要的一員，其激活途徑在不同細胞中有所不同，且取決于其生理或應激水平。當脂多糖、NO等炎性刺激源出現，可刺激中性粒細胞等炎性細胞激活p38，活化后的p38進入細胞核，引起細胞核內NF-κB等相關因子磷酸化并過度表達，繼而使多形核白細胞出現粘附和聚集現象，最終導致組織出現炎癥損傷反應[23]。本實驗中，ACN高劑量組p-p38和p38蛋白表達水平及p-p38/p38比值均顯著高于對照組和NAC組，這些結果表明ACN慢性染毒可引起大鼠腦組織p-p38 蛋白表達水平升高，進而激活p38 MAPK信號通路，且NAC對ACN誘導激活的p38 MAPK信號通路具有一定的抑制作用。這可能與腦組織NO含量生成增加，使ONOO-生成增加，引起腦組織發生氧化應激，引起位于p38 MAPK信號通路上游的daf-16激活，進而調控DAF-16進入細胞核，進而激活p38 MAPK信號通路有關[24]。同時NAC可以通過對抗體內ONOO-等氧化物質水平的升高而抑制p38 MAPK信號通路的激活。

綜上所述，在本實驗條件下，ACN慢性染毒可引起大鼠腦組織iNOS表達水平升高，NO含量增加，并激活p38 MAPK信號通路，這可能是ACN引起中樞神經毒性作用的機制之一。抗氧化劑NAC通過降低ACN誘導的腦組織氧化應激水平從而抑制iNOS/p38 MAPK信號通路的活化，提示活性氧(ROS)可能參與iNOS/p38 MAPK信號通路的活化過程，但有待于進一步研究驗證。

通訊作者簡介：李芝蘭(1962—)，女，碩士研究生導師，教授，蘭州大學公共衛生學院兒少衛生與婦幼保健學研究所所長，研究方向為婦女勞動衛生與生殖健康。

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