大氣中細顆粒物對肺癌細胞A549遷移和侵襲作用的影響

樊磊，劉順，包艷英，張英杰，劉穎，屈超，張治然，襲榮剛，王曉波,*

1. 中國人民解放軍第210醫院藥學部，大連 116021 2. 大連市環境監測中心，大連 116023

自1985年以來，肺癌已成為全世界發病率和死亡率最高的惡性腫瘤。據《中國腫瘤登記年報》2015年中國癌癥統計[1]數據顯示，肺癌也是中國發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，在過去的30年中，肺癌死亡率在中國上升了465%。國內外環境流行病學研究表明，大氣污染程度與城市居民肺癌的發病率和死亡率關聯密切[2]。據Anenberg等[3]統計分析，目前全球每年約有14～30萬例肺癌患者的死亡與大氣中細顆粒物暴露有關。Pope等[4]調查發現，大氣中細顆粒物濃度每升高10 μg·mL-1，肺癌病死率增加約8%。雖然流行病學調查顯示肺癌發病率和病死率與大氣中細顆粒物具有統計學相關性，但其因果聯系尚待進一步的毒理學、生物學等機制研究予以闡明。以PM2.5為代表的大氣細顆粒物是目前研究的熱點，其粒徑小，表面積大，易富集各種重金屬及多環芳烴等有機物和病原微生物。這些顆粒物可沉積在細小支氣管和肺泡[5]，并容易通過肺泡內皮細胞進入血液循環。實驗研究發現，PM2.5可通過誘導氧化應激反應產生心血管毒性[6]、加速皮膚細胞衰老、導致胚胎畸形[7]。PM2.5的致癌作用主要與其可導致遺傳毒性、激活氧化應激通路、免疫損傷以及慢性炎癥反應等作用有關[8-10]。

由于肺癌發病隱匿，早期往往沒有任何癥狀。所以，在臨床中發現的肺癌患者確診時約有80%以上已發展到中晚期，患者五年生存率不足10%[11]。肺癌轉移是影響患者生存期限的主要因素，PM2.5是否能促進肺癌細胞轉移目前尚不清楚，因此，在本實驗中我們觀察了PM2.5對A549肺癌細胞轉移相關表型的影響，旨在進一步闡明PM2.5對肺癌發生發展的作用及其機制，為對其醫學防治提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑與儀器

人肺癌細胞系A549購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。Gibco杜爾伯科改良伊格爾培養基(DMEM)和Gibco胎牛血清均購自美國Invitrogen公司，抗體MMP-2、抗體MMP-9、抗體E-cadherin、抗體N-cadherin和抗體GAPDH-A均購自美國Cell Signaling公司，人工基底膜Matrigel購自美國BD Biosciences公司，TGL-20M高速臺式冰凍離心機購自中國湘儀公司，PAC300 型電泳儀購自美國BIO-RAD公司，TS 2000A 型脫色搖床購自江蘇海門市分析儀器廠，Amersham Imager 600化學發光成像系統購自美國GE公司，BPN-150CRH型CO2細胞恒溫培養箱購自蘇州貝茵醫療器械有限公司，PQ200 環境級精細顆粒物采樣器購自美國BGI公司。

1.2 大氣PM2.5樣品采集

采集工作由大連市環境監測中心完成，采樣點位于大連市主城區，采樣裝置流量設定為1.13 m3·min-1。本實驗中使用的PM2.5顆粒為11月采集獲得，采樣時間為24 h連續采樣，在空氣重污染期間加密采樣，采樣濾膜密封盒-20 ℃保存。

1.3 PM2.5 染毒懸液制備

制備方法參考文獻[12]進行，具體方法如下：將采樣濾膜按1 cm×1 cm剪裁，放入0 ℃預冷去離子水中超聲振蕩3次，每次20 min，收集洗脫液后用多層脫脂紗布過濾，再用 5 μm 微孔濾膜過濾，濾液4 ℃、 12 000 r·min-1離心 30 min，收集下層懸液冷凍過夜，真空冷凍干燥成干粉，稱量PM2.5干粉后用環氧乙烷滅菌，再加入無菌生理鹽水配制成 1 000 mg· mL-1的母液， -80 ℃避光保存備用。 染毒前超聲振蕩使顆粒物充分混勻，用細胞培養液稀釋成所需工作液。

1.4 MTT 比色法檢測PM2.5對A549細胞活性的影響

將細胞消化、重懸并吹打成單個細胞后計數，將細胞密度調整成1×104個·mL-1，按每孔200 μL細胞懸液接種到96孔板中，繼續培養24 h后給藥。實驗分組為：空白對照組，溶劑對照組，不同濃度給藥組，每組設置6個復孔。給藥24 h后，每孔加入20 μL噻唑藍溶液(MTT)后繼續培養4 h，吸盡各孔培養液，每孔加入200 μL的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。用酶聯免疫檢測儀在570 nm波長處測定每孔的吸光度值(OD值)，計算各組吸光度的平均值，按照下列公式計算細胞生存率：生存率%=(OD給藥組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.5 PM2.5對A549細胞在細胞外基質上黏附的測定

用10 mg·L-1纖連蛋白(Fibronectin)，50 mg·L-1人工基底膜(Matrigel) 1:8稀釋液和10 g·L-1牛血清蛋白(BSA)作為基底膜包被96 孔板，BSA為對照基底，4 ℃過夜。加入含1% BSA的DMEM無血清培養液 (50 μL·孔-1) 37 ℃孵育30 min水化基底膜。胰酶消化PM2.5處理24 h的A549細胞，計數并以1×105個·孔-1接種于96孔板中，每組設置6個復孔。37 ℃培養1 h后，移去細胞懸浮液，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)輕洗3次，除去未貼壁細胞。按照MTT比色法測定各孔細胞在490 nm波長處光吸收值(OD值)，以BSA對照基底膜OD值為參考，按公式分別計算細胞在Matrigel和Fibronectin上的黏附率：黏附率(%)=[(各組細胞OD值/BSA組細胞OD值)-1]×100% 。

1.6 Western blot 法測定PM2.5對A549細胞轉移相關蛋白表達的影響

接種A549細胞于6 孔板中，每孔 2×105個細胞，培養24 h后給予PM2.5，繼續孵育24 h。提取細胞內總蛋白，采用 BCA法測定蛋白濃度。向細胞裂解液中加入適當體積的5×蛋白上樣緩沖液，混勻后置于沸水中5 min。根據蛋白濃度，按照 20 μg/樣品的總蛋白量計算電泳上樣量。選用6%的濃縮膠和12%的分離膠進行蛋白電泳，電泳結束后將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。依據蛋白分子量的指示，按照目標蛋白的分子量剪裁PVDF膜后放入用PBST配制的5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉 2 h。加入一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，加入相應二抗稀釋液室溫孵育2 h。采用化學法發光，使用Amersham Imager 600凝膠成像系統顯影。用Image J軟件分析發光得到蛋白條帶，記錄灰度值用于統計分析。

1.7 細胞劃痕愈合實驗

用記號筆在6孔板背后畫3條間隔均勻的直線作為定位線。將A549細胞按照每孔5×105個接種于6孔板中，繼續培養至細胞均勻鋪滿培養孔底部后用100 μL的移液槍頭在細胞上劃痕，垂直于定位線。將劃痕與定位線的交點作為監測點。用PBS洗凈漂浮細胞后加入含1%胎牛血清的培養基，在倒置顯微鏡下拍照記錄監測點的劃痕寬度，作為0 h時間點記錄。給予相應濃度的PM2.5，將細胞繼續培養24 h后拍照記錄監測點的劃痕寬度。用Image J軟件計算劃痕寬度，按照公式計算劃痕愈合率：劃痕愈合率%=[1-( 24 h劃痕寬度/ 0 h劃痕寬度)]×100%。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.8 細胞侵襲實驗

實驗方法具體如下[13]：將人工基底膜Matrigel按照1:8的比例與預冷DMEM混勻后按照每孔50 μL加入Transwell小室，使其均勻鋪滿小室底膜。將Transwell小室置于24孔板中，放入4 ℃冰箱過夜。于接種細胞前2 h將培養板從冰箱中取出，放入37 ℃培養箱中孵育。將A549細胞按照每孔5×104接種于Transwell小室中。小室下部的細胞培養液中加入含10 ng·mL-1的EGF，含10%胎牛血清的細胞培養液1 mL。細胞接種6 h后給予相應濃度的PM2.5，設置一個對照組，每組3個復孔，設置一組不加細胞的小室為空白對照孔。給PM2.5后繼續培養細胞24 h，取出Transwell小室，用4%多聚甲醛溶液固定15 min，待風干后置于0.1%的結晶紫乙醇溶液中染色15 min。染色后用PBS漂洗Transwell小室，并用棉簽將小室底膜上部未穿膜細胞擦去，小室下部即為侵襲細胞。在顯微鏡下觀察后拍照，再將小室底膜浸入300 μL、33%的乙酸溶液中，使細胞中的結晶紫全部溶解于乙酸中。將溶解了結晶紫的乙酸溶液移入96孔板中，用酶標儀檢測乙酸溶液在570 nm波長下的吸光值(OD)，將空白對照孔的吸光值作為背景在計算各組OD值時減去。

1.9 明膠酶譜法檢測細胞培養液基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9活性

給予A549細胞PM2.5后在無血清培養基DMEM中培養24 h，收集培養液上清，將上清液移入離心管中 2 000 r·min-1離心10 min， 測定上清蛋白濃度后與5×上樣緩沖液混合，配制含1%明膠的分離膠和不含明膠的濃縮膠，根據蛋白濃度確定上樣量，低溫電泳100 V 1.5 h；電泳結束后將凝膠置于洗脫液(2.5% Triton X-100，50 mmol·L-1Tris -HCl，5 mmol·L-1CaCl2，pH=7.6)中振蕩洗脫后用漂洗液(除不含Triton X-100外其余同洗脫液) 漂洗，接著將凝膠置于孵育液(50 mmol·L-1Tris - HCl, 10 mmol·L-1CaCl2, 0.02% Brij-35, pH7.6) 中37 ℃孵育42 h；孵育結束后經染色液(0.05% 考馬斯亮藍、30%甲醇、10%乙酸) 染色3 h，以及脫色液A、B、C(甲醇濃度分別為30%、20%、10%，乙酸濃度分別為10%、10%、5%) 分別脫色0.5、1、2 h后，顯示出MMP-2(72 KD) 和MMP -9(92 KD)為位于藍色背景上的透亮帶，用凝膠圖像分析系統分析讀取條帶面積、寬度和灰度值，進行統計學分析。

1.10 統計學方法

2 結果(Results)

2.1 不同濃度 PM2.5對A549細胞存活率的影響

給予A549細胞不同濃度的PM2.5作用24 h后，MTT法測定細胞存活率可以得出，細胞的存活率隨PM2.5濃度的增加而減少(見圖1)，當PM2.5濃度大于等于12 μg· mL-1時，細胞存活率與正常對照組相比具有統計學差異(P<0.01)，利用軟件計算PM2.5對A549細胞的IC50為11 μg·mL-1。

2.2 PM2.5對A549細胞在細胞外基質上黏附性的影響

PM2.5預處理細胞后，A549細胞與Matrigel和Fibronectin這2種基質的黏附能力較正常對照組均有所增強(P<0.01)，結果如表1所示。

2.3 PM2.5對A549細胞運動遷移作用的影響

細胞劃痕愈合實驗是檢測細胞運動遷移能力的實驗之一。在腫瘤轉移過程中，細胞異常增強的遷移能力是腫瘤細胞穿越組織屏障的細胞生物基礎[14]。由于高濃度的PM2.5可明顯降低細胞存活率，因此為了排除PM2.5的細胞毒作用對實驗結果的影響，我們根據之前實驗測得的IC50值，選用10 μg·mL-1和 20 μg·mL-1為給藥濃度，并在以下實驗中，均用該濃度給藥。為了避免細胞增殖對結果的影響，本實驗選擇含低濃度(1%)血清的細胞培養基，并且選擇的時間點在細胞增殖周期以內(24 h)。用不同濃度的PM2.5處理細胞，結果發現PM2.5可刺激A549細胞的遷移速率。如圖2所示，不同濃度的PM2.5明顯增加了細胞劃痕的愈合率，與對照組相比有顯著差異(P<0.01)。

圖1 PM2.5對A549細胞存活率的影響Fig. 1 Effects of PM2.5 on the survival rate of A549 cells

組別Group與Matrigel的粘附率/%Adhesion rates with Matrigel/%與Fibronectin的粘附率/%Adhesion rates with Fibronectin/%正常對照組Control group24.6±3.323.1±2.5溶劑對照組Vehicle control group23.2±2.624.5±3.4低濃度PM2.5暴露組Low concentration PM2.5 exposure group37.1±3.5*35.2±2.2*高濃度PM2.5暴露組High concentration PM2.5 exposure group59.3±3.1*56.1±3.3*

注：*P<0.05與正常對照組對比。

Note:*P<0.05 compared with control group.

圖2 PM2.5對A549細胞運動遷移的影響注：A. 利用劃痕實驗觀察不同濃度的PM2.5處理A549細胞24 h后，劃痕的愈合情況照片；B. 測量劃痕寬度，按照公式計算劃痕愈合率：劃痕愈合率%=[1-( 24 h劃痕寬度/ 0 h劃痕寬度)]×100%。Fig. 2 Effects of PM2.5 on cell migration of A549 cellsNote：(A) Migration of cancer cell line A549 was assessed by wound-healing assay. A scratch wound was created on the cell surface and then PM2.5 were added. The cultures were photographed at 0 h and 24 h. (B) The cell wound closure rate was measured at 24 h and was calculated according to the equation: Wound closure% = [1 -(wound area at Tt / wound area at T0)] × 100%.

圖3 PM2.5對A549細胞侵襲能力的影響注：A. 用不同濃度的PM2.5處理A549細胞24 h后，進入小室下膜的細胞結晶紫染色照片(100×)；a. 正常對照組，b. 溶劑對照組，c. 低濃度PM2.5暴露組，d. 高濃度PM2.5暴露組。B. 乙酸溶解小室下膜細胞中結晶紫后在570 nm波長下的吸光值。*P<0.05與正常對照組對比。Fig. 3 Effect of PM2.5 on invasion of A549 cellsNote: A. Cells were treated with various concentrations of PM2.5 for 24 h, and cell invasion assay was performed. The invaded cells were photographed (100× magnification), a. control group, b. vehicle control group, c. low concentration PM2.5 exposure group, d. high concentration PM2.5 exposure group. *P<0.05 compared with control group.

2.4 PM2.5對A549細胞侵襲能力的影響

在腫瘤細胞體外侵襲實驗中，腫瘤細胞被小室下部的營養物質所驅動，通過分泌基質酶降解鋪在小室內膜表面的基質膠，從膜微孔中穿透后抵達小室下方。抵達小室下方的細胞數量反映了腫瘤細胞的侵襲能力。實驗結果表明PM2.5可增加A549細胞進入小室下膜的細胞數量，提示其侵襲能力在PM2.5的作用下得到增強。如圖3所示。

2.5 PM2.5對A549細胞基質金屬蛋白酶活性的影響

上述研究表明，PM2.5對A549細胞侵襲能力具有明顯的促進效應，而基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是影響細胞侵襲能力的重要酶類，具有侵襲能力的腫瘤細胞均可分泌MMPs。為研究PM2.5對A549細胞侵襲能力的影響是否與MMPs的活性有關，我們利用明膠酶譜試驗檢測了MMPs的2個亞型MMP-2和MMP-9的活性。腫瘤細胞中MMP-2和MMP-9的活性與其侵襲能力密切相關，明膠是這2種酶的作用底物，通過酶譜法檢測樣本中MMP-2和MMP-9對明膠的分解效應，可判斷其酶活性。結果發現給予A549細胞PM2.5處理24 h后，2個濃度組中細胞分泌的MMP-2和MMP-9活性均明顯增加，結果如圖3所示。

2.6 PM2.5對A549細胞轉移相關蛋白表達的影響

通過Westem blot實驗檢測A549細胞轉移相關蛋白表達的變化。其中與細胞侵襲相關的蛋白MMP-2、MMP-9表達明顯增加，而細胞黏附蛋白E-cadherin表達量下降，N-cadherin的表達量升高，如圖4所示。

3 討論(Discussion)

國內外流行病學研究顯示PM2.5暴露水平與肺癌的發病率及病死率呈正相關[15-17]，PM2.5導致肺癌發生和發展的病理生理機制也得到了實驗性研究結論的初步闡明。PM2.5的化學組分中，重金屬、多環芳香烴等成分已被證實與肺癌的發生有確切的因果關系，這些物質可通過損傷免疫系統、氧化應激、抑制DNA修復和增加DNA突變率等多種途徑誘發肺癌。腫瘤轉移是影響肺癌患者預后的重要因素，關于PM2.5促進肺癌轉移的研究報道較少，吳鴻章等[12]研究發現，PM2.5暴露能通過上調血管內皮生長因子(VEGF)、MMP-9與低氧誘導因子-1α (HIF-1α)基因的表達，促進肺癌移植瘤新生血管形成。腫瘤轉移是多因素、多步驟的生物學過程，細胞的遷移、黏附和侵襲是腫瘤細胞轉移中的關鍵步驟，我們通過細胞-基質黏附實驗、細胞劃痕愈合實驗和細胞侵襲實驗研究了大氣來源的PM2.5對這3個關鍵步驟的影響。由于較高濃度的PM2.5可以明顯抑制腫瘤細胞的活性，因此我們根據MTT比色實驗獲得的IC50選用較低的給藥濃度以排除PM2.5對細胞增殖和凋亡的影響。細胞劃痕實驗是一種體外檢測細胞遷移運動能力的實驗，腫瘤細胞的運動能力與其轉移能力密切相關[18]，我們發現PM2.5可明顯增加A549細胞劃痕的愈合速率，說明細胞的遷移能力受到了影響，腫瘤的轉移潛力可能增強。高侵襲的腫瘤細胞與基底膜成分的異質性黏附能力通常增高，而腫瘤細胞間的同質性黏附能力則會下降。這有利于腫瘤細胞與腫瘤母體分離，并侵犯基底膜等正常組織。本實驗發現，PM2.5能增加A549細胞與細胞外基質Matrigel和Fibronectin的黏附率，細胞間黏附蛋白E-cadherin表達下降，而細胞-基質黏附蛋白N-cadherin表達升高初步揭示了PM2.5影響A549細胞-基質黏附作用的機制。E-cadherin表達下降，N-cadherin表達升高也是腫瘤細胞從上皮細胞向間充質細胞轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的重要表型，腫瘤細胞可通過EMT獲得遷移和侵襲能力[19]。研究發現，香煙提取物可通過激活Rac1/Smad2和Rac1/PI3K/Akt信號通路促進EMT的發生，進而導致肺上皮細胞出現轉移潛能增強[20]，本實驗表明：大氣來源的PM2.5同樣具備該效應。

圖4 PM2.5對A549細胞基質金屬蛋白酶MMP-9和MMP-2活性的影響Fig. 4 Effect of PM2.5 on activities of MMP-2 and MMP-9 in A549 cells

圖5 PM2.5對A549細胞轉移相關蛋白表達的影響Fig. 5 Effect of PM2.5 on the expression of metastasis associated proteins in A549 cells

隨后，我們研究了PM2.5對A549細胞穿透基質膠能力的影響，結果發現PM2.5處理后，可穿透基質膠的細胞數量明顯增加，說明PM2.5可明顯增加細胞的侵襲能力。由于A549細胞的侵襲能力與其分泌的基質金屬蛋白酶(MMPs)相關，我們利用明膠酶譜實驗檢測了PM2.5對A549細胞培養液中MMPs的活性的影響。結果發現，A549細胞分泌的基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9活力在PM2.5作用后均明顯增強。Western blot 結果顯示細胞中基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的蛋白表達量也明顯升高，說明這2種基質金屬蛋白酶活力增強可能與其蛋白表達量升高有關。

綜上所述，高濃度的PM2.5具有較強的細胞毒作用，而較低濃度的PM2.5可促進細胞-基質黏附、增加細胞遷移速率和侵襲能力。該結果提示PM2.5可能通過增強上述細胞生物學作用促進肺癌轉移，但本實驗僅是體外細胞實驗且PM2.5樣本來源有限，實驗結果具有一定局限性，該效應及其機制還有待進一步體內研究證實和深入。

通訊作者簡介：王曉波(1961-)，男，藥學博士，主任藥師，教授，博士研究生導師，主要研究方向為新藥研發、藥物分析，發表學術論文200余篇。

參考文獻(References)：

[1] Chen W, Zheng R, Baade P D, et al. Cancer statistics in China, 2015 [J]. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2016, 66(2): 115-132

[2] 張曉, 楊瓊英, 林國楨, 等. 大氣污染與居民肺癌發病及死亡灰色關聯分析[J]. 中國公共衛生, 2014, 30(2): 165-171

Zhang X, Yang Q Y, Lin G Z, et al. Grey relational analysis on association between urban air pollution and lung cancer in China [J]. Chinese Journal of Public Health, 2014, 30(2): 165-171 (in Chinese)

[3] Anenberg S C, Horowitz L W, Tong D Q, et al. An estimate of the global burden of anthropogenic ozone and fine particulate matter on premature human mortality using atmospheric modeling [J]. Environmental Health Perspectives, 2010, 118(9): 1189-1195

[4] Pope C A, Burnett R T, Thun M J, et al. Lung cancer, cardiopulmonary mortality, and long-term exposure to fine particulate air pollution [J]. The Journal of the American Medical Association, 2002, 287(9): 1132-1141

[5] 董雪玲. 大氣可吸入顆粒物對環境和人體健康的危害 [J]. 資源產業, 2004, 6(5): 50-53

Dong X L. Impact of inhalable particles in atmosphere on environment and human health [J]. Resources and Industries, 2004, 6(5): 50-53 (in Chinese)

[6] Ying Z, Xie X, Bai Y, et al. Exposure to concentrated ambient particulate matter induces reversible increase of heart weight in spontaneously hypertensive rats [J]. Particle and Fibre Toxicology, 2015, 12: 15

[7] Kim J Y, Lee E Y, Choi I, et al. Effects of the particulate matter 2.5 (PM2.5) on lipoprotein metabolism, uptake and degradation, and embryo toxicity [J]. Molecules and Cells, 2015, 38(12): 1096-1104

[8] 樓煜清, 韓寶惠. PM2.5對呼吸系統腫瘤發生發展的影響[J]. 臨床內科雜志, 2015, 32(4): 234-237

Lou Y Q, Han B H. The effects of PM2.5on the occurrence of tumor development in respiratory system [J]. Journal of Clinical Internal Medicine, 2015, 32(4): 234-237 (in Chinese)

[9] Dai L, Mehta A, Mordukhovich I, et al. Differential DNA methylation and PM2.5species in a 450K epigenome-wide association study [J]. Epigenetics, 2017, 12(2): 139-148

[10] Chu J H, Hart J E, Chhabra D, et al. Gene expression network analyses in response to air pollution exposures in the trucking industry [J]. Environmental Health: A Global Access Science Source, 2016, 15(1): 101-111

[11] Frazier J L, Garonzik I M, Rhines L D. Metastatic Lung Cancer [M]. Blackwell Publishing, Inc., 2008: 199-220

[12] 吳鴻章, 方來, 麻慶樂, 等. 大氣細顆粒物 PM2.5對肺癌血管新生的影響[J]. 浙江中醫藥大學學報, 2016, 40(10): 723-734

Wu H Z, Fang L, Ma Q L, et al. Effect of PM2.5induced angiogenesis in lung cancer [J]. Journal of Zhejiang Chinese Medical University, 2016, 40(10): 723-734 (in Chinese)

[13] Fan L, Li Y, Sun Y, et al. Paris Saponin VII inhibits the migration and invasion in human A549 lung cancer cells [J]. Phytotherapy Research, 2015, 29(9): 1366-1372

[14] Friedl P, Wolf K. Tumour-cell invasion and migration: Diversity and escape mechanisms [J]. Nature Reviews Cancer, 2003, 3(5): 362-374

[15] Yang B, Chen D, Zhao H, et al. The effects for PM2.5exposure on non-small-cell lung cancer induced motility and proliferation [J]. Springer Plus, 2016, 5(1): 2059-2068

[16] Chen L, Shi M, Gao S, et al. Assessment of population exposure to PM2.5for mortality in China and its public health benefit based on BenMAP [J]. Environmental Pollution, 2017, 221: 311-317

[17] Badyda A J, Grellier J, Dadrowiecki P. Ambient PM2.5exposure and mortality due to lung cancer and cardiopulmonary diseases in Polish cities [J]. Advances in Experimental Medicine and Biology, 2017, 944: 9-17

[18] Wells A, Grahovac J, Wheeler S, et al. Targeting tumor cell motility as a strategy against invasion and metastasis [J]. Trends in Pharmacological Sciences, 2013, 34(5): 283-289

[19] Seyfried T N, Huysentruyt L C. On the origin of cancer metastasis [J]. Critical Reviews in Oncogenesis, 2013, 18(1-2): 43-73

[20] Shen H J, Sun Y H, Zhang S J, et al. Cigarette smoke-induced alveolar epithelial-mesenchymal transition is mediated by Rac1 activation [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2014, 1840(6): 1838-1849