通腑瀉肺方對ALI/ARDS大鼠AQP1/a-ENaC表達的影響

廉 富，蘇景深，劉恩順，鄭 莉，趙鑫民，陳善夫

急性肺損傷（ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是一種炎癥反應，多種炎癥介質和細胞因子參與發病，失控的炎癥反應損傷肺泡毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞，導致肺水清除能力下降，肺含水量增加，形成肺水腫,氣體交換障礙,從而導致嚴重低氧血癥[1]。水通道蛋白（AQPs）是一組在哺乳動物體內表達的水選擇通道的分子家族，可以增強漿膜面水通透力的功能，因而可以提供快速液體轉運的通路[2]。肺上皮細胞鈉通道（ENaC）由α、β和γ 3個亞型組成，廣泛分布于肺Ⅰ型[3]和Ⅱ型[4]上皮細胞，是肺泡腔水腫液清除（AFC）的關鍵作用環節。本研究探討了內毒素（LPS）誘導的急性肺損傷大鼠模型中AQP1和a-ENaC蛋白的表達調節及通腑瀉肺中藥干預的作用。

1 材料

1.1 動物 健康SD大鼠27只，雄性，體質量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（許可證號：SCXX（京）2012－0001），購入后置天津工程所實驗中心常規飼養。

1.2 藥物及試劑 通腑瀉肺方（葶藶子、桑白皮、大黃、枳實、厚樸）中藥顆粒劑，購自天津中醫藥大學第二附屬醫院藥房。大腸桿菌內毒素脂多糖購自Sigma公司。AQP1抗體購自Abcam公司，批號：Ab11025；a-ENaC抗體購自Proteintech公司，10924-2-AP。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

2 方法

2.1 ALI/ARDS模型的建立及分組給藥 動物購入后適應性飼養1周，將大鼠按體質量隨機分為空白組、模型組、中藥組，每組9只。模型組與中藥組于左側尾靜脈注射內毒素8 mg/kg，復制ALI/ARDS模型。正常對照組大鼠靜脈注射生理鹽水。對照組與模型組在造模完成后即用生理鹽水灌服，每次0.01 mL/g。治療組在造模完成后給予通腑瀉肺中藥灌胃，每次0.01 mL/g，每日1次，共7 d。

2.2 鏡下觀察 給藥1周后，取右肺下葉，應用10%甲醛溶液進行固定，常規石蠟切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色檢測。光鏡下觀察，比較分析各組大鼠肺組織病理學改變。

2.3 免疫組化染色方法檢測檢測肺組織AQP1和a-ENaC的表達 將組織切片行脫蠟、水化處理后，高壓修復抗原，用3%過氧化氫溶液消除內源性過氧化酶，血清封閉后各組切片分別加入兔源性AQP-1、a-ENaC多克隆抗體（均為1∶100稀釋），4℃過夜后加入兔二抗，經二氨基聯苯胺（DAB）顯色，光鏡下觀察。AQP-1、a-ENaC的陽性反應產物均呈棕黃色。光學顯微鏡下隨機觀察5個視野、拍照，代表該動物肺組織AQP-1、a-ENaC的蛋白表達強度。應用Image-Pro Plus6．0軟件分析陽性細胞數，同時將空白對照組陽性細胞率設置為100%，計算其他組別的陽性細胞率，并對結果進行統計分析。

2.4 統計學方法 采用SPSS 19．0統計軟件包進行統計分析，數據以均數±標準差（x±s）表示。多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗，P＜0．05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 肺組織病理學表現 空白組大鼠肺組織光鏡下可見大部分肺泡結構正常、充盈良好，無肺泡萎陷；少部分肺泡間隔增寬、充血、少量淋巴細胞浸潤，未見肺泡萎陷；灶性肺間質、細支氣管周少量淋巴細胞浸潤。模型組大鼠肺組織光鏡下可見廣泛肺泡萎陷，肺泡間隔增寬、充血、較多淋巴、中性粒細胞、巨噬細胞浸潤，局部呈實性。部分肺泡腔可見少量紅細胞、淋巴、中性粒及巨噬細胞滲出；部分細支氣管及終末細支氣管周可見大量淋巴細胞浸潤、淋巴組織增生。中藥組大鼠肺組織鏡下大部分肺泡結構正常、充盈良好，無肺泡萎陷；部分肺泡間隔增寬、充血、纖維組織增生，較多淋巴細胞為主的炎細胞浸潤，可見肺泡萎陷；偶見細支氣管周灶性淋巴細胞浸潤，見圖1。

圖1 大鼠肺組織形態學改變(SP,×100)Fig.1 Histology changes of lung in rats(SP,×100)

3.2 AQP1和a-ENaC在肺組織的分布及表達情況 空白組大鼠肺組織中AQP1和a-ENaC均呈高水平表達，AQP1主要分布在肺組織微血管的內皮細胞膜，以及少部分分布在肺上皮細胞膜，見圖2。a-ENaC主要分布在肺泡細胞膜，見圖3。與空白組比較，模型組可見 AQP1 表達顯著下降（P＜0．01）；中藥組經過治療干預后，AQP1表達增強，差異具有統計學意義（P<0．05）。與空白組比較，模型組可見a-ENaC 表達顯著下降（P＜0．01）；中藥組經過治療干預后，a-ENaC 表達增強，差異具有統計學意義（P＜0．01）。見表1。

圖2 AQP1在肺組織的分布與表達(SP,×400)Fig.2 Distribution and expression of AQP1 in lung tissue(SP,×400)

圖3 a-ENaC在肺組織的分布及表達(SP,×400)Fig.3 Distribution and expression of a-ENaC in lung tissue(SP,×400)

表1 大鼠肺組織AQP-1、a-ENaC免疫組織化學表達的平均光密度值（x±s）Tab.1 The mean optical density of AQP-1 and a-ENaC in lung tissue of rats（x±s）

4 討論

ALI/ARDS狀態下肺微血管的通透性增高，肺泡上皮受損，導致大量血管內液滲透到肺間質及肺泡內，引起肺泡內及肺間質大量肺水形成的高通透性水腫[5]。研究發現的AQPs包括AQP 0～12共13種亞型。其中，AQP-1主要分布于微血管內皮細胞、支氣管周圍血管床、氣管黏膜、淋巴管、胸膜和Ⅱ型肺泡上皮細胞[6]。敲除AQP1基因的小鼠肺泡毛細血管通透性較野生型發生顯著改變，肺泡毛細血管膜屏障通透性下降10倍左右[7]。ENaC通過主動吸收肺泡腔內的鈉離子實現的肺泡液體吸收主要途徑,是肺水腫清除的決定因素[8]。ENaC主動轉運將肺泡腔內的鈉離子轉運入肺泡Ⅱ型細胞內，隨后位于基底膜的鈉/鉀ATP酶再將鈉離子轉運至肺間質，其中主動轉運為肺水腫液清除提供了源動力，將肺水腫液體繼發性主動轉運至間質，并通過靜脈和淋巴回流，從而減輕肺水腫。整個轉運過程中90%的跨膜轉運阻力存在于ENaC中，因此ENaC是肺泡腔內鈉水重吸收的限速步驟[9]。a-ENaC基因敲除小鼠因肺水腫液清除能力低下而在出生后死于ARDS[10]。

通腑瀉肺方藥源自中醫學“肺與大腸相表里”理論，肺與大腸通過經脈相連，兩者在生理功能上相互協調，而在發生病理變化時又相互影響。通腑用小承氣湯，方中大黃具有破積聚、蕩滌胃腸等功效。厚樸行氣散滿，枳實破氣消痞，諸藥合用，可以輕下熱結，除滿消痞。瀉肺用葶藶子，性大寒，味辛、苦，歸肺、膀胱經，功能瀉肺平喘，行水消腫；桑白皮，甘寒入肺，功能瀉肺平喘，利水消腫。上述兩者合用為通腑瀉肺方，既可瀉肺平喘，又能通腑瀉熱，肺腸同治。前期研究發現通腑瀉肺方可以明顯減輕ALI/ARDS大鼠炎癥因子水平的表達，減輕肺部的炎癥反應[11-12]。

實驗結果發現，通腑瀉肺中藥組肺組織病理損傷減輕，免疫組化方法檢測發現其可上調肺組織AQP1和a-ENaC表達。提示通腑瀉肺中藥減輕ALI/ARDS大鼠肺水腫的機制可能在于其提高AQP1和a-ENaC表達，促進肺水腫的吸收，為臨床治療提供了新思路。

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