速效救心丸對動脈粥樣硬化大鼠血脂、主動脈形態及主動脈壁ABCA1表達的影響

王莎莎，曲竹秋

速效救心丸由川芎、冰片等組成，具有活血化瘀、行氣止痛的作用。臨床多用于治療冠心病心絞痛的急性發作，在臨床20余年的應用中，大量藥理臨床試驗證明速效救心丸具有抗動脈粥樣硬化（AS）作用。本實驗將采用高脂飲食加大劑量鈣負荷方法建立大鼠AS模型，觀察不同劑量速效救心丸對于AS大鼠血脂變化，通過透射電鏡觀察其對主動脈病理形態學影響，并應用免疫組織化學方法，探討速效救心丸對脂代謝途徑的影響，觀察主動脈壁ABCA1的表達情況。

1 材料

1.1 動物 采用2～3月齡健康清潔級SD大鼠60只，雄性，體質量（256±20）g。由中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心提供。飼養于天津醫科大學動物實驗中心標準化飼養房。

1.2 藥物 速效救心丸由天津中新藥業第六中藥廠惠贈；阿托伐他汀由美國輝瑞制藥有限公司生產；維生素D3注射液，由上海通用藥業生產。

2 方法

2.1 動物造模 大鼠動脈粥樣硬化模型制備參照文獻[1]方法加以改進，采用一次性腹腔注射60萬U/kg維生素D3，并同時予以高脂飼料（配方：基礎飼料配方中添加2%膽固醇、0．5%膽酸鈉、0．2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油）喂養12周后，抽樣檢測大鼠主動脈，以發現AS斑塊為造模成功。

2.2 動物分組與給藥 將60只大鼠適應性飼養1周后稱取體質量，采用隨機區組方法分成6組，每組10只。正常組：基礎飼料飼養，灌胃用生理鹽水每天0．5 mL/100 g；模型組：灌胃用生理鹽水每天0．5 mL/100 g、速效救心丸低劑量組、中劑量組、高劑量組及西藥組所用藥量：根據臨床成人常用量，按照體重系數折合成大鼠用量：速效救心丸低、中、高劑量組分別為：60 mg/kg、600 mg/kg、1800mg/kg，阿托伐他汀：4mg/kg。按大鼠0．5mL/100g灌胃量，將上述藥物溶于蒸餾水，每日灌胃1次，連續灌胃12周。

2.3 血脂的測定 于實驗第12周末最后1次灌胃后，禁食12 h于次日晨將全部動物股動脈放血處死，留取血標本，分離血清，全自動生化分析儀測定總膽固醇（TC）、甘測三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）。

2.4 主動脈電鏡標本制備觀察 大鼠處死后迅速解剖，分離主動脈弓至髂總動脈分叉處的整條主動脈，仔細剔除血管外脂肪及結締組織，剪取主動脈弓，冷生理鹽水洗去血管壁內外血跡，切取（1×1）mm3動脈環3個，經過常規前固定、清洗、后固定、清洗、脫水、浸透、包埋、聚合、超薄切片、電子染色、用日立H-7500型透射電子顯微鏡觀察、照相。

2.5 免疫組化標本制備及測定步驟 于主動脈弓下緣水平切取主動脈長約1～2 cm，冷生理鹽水洗去血管壁內外血跡后，置入10%福爾馬林溶液中固定24 h后，常規脫水、透明、浸蠟、包埋、連續切片厚度4 μm，40℃恒溫水浴撈片，貼于普通載玻片上，供免疫組化用。SABC法，陽性表達均以棕黃色或褐色顆粒為準，Frank半定量計分法進行判定。染色面積以百分率計分，≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；按著色強度計分，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩個評分相乘所得的染色分數進行半定量分析，每例隨機觀察5個高倍視野，取其平均值作為半定量結果。

2.6 統計方法 采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行處理，實驗結果采用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 血脂及AI值變化 檢測結果見表1。實驗結果表明，與模型組相比，速效救心丸中、高劑量組和西藥組可降低血清TC、TG和LDL含量及AI值，（P＜0.05），速效救心丸高劑量組和西藥組可以升高血清HDL水平（P＜0.05）。而低劑量組對血脂各項指標則無明顯影響（P＞0.05）。

3.2 主動脈透射電子顯微鏡觀察結果 結果見圖1。正常組主動脈內膜薄，內皮細胞扁平，表面較平滑，呈長梭形，細胞器結構正常，細胞間連接緊密，內皮下間隙較小，無脂質沉積，內彈力板完整連續；中膜平滑肌細胞（SMC）大小均勻，核形態規則，細胞器結構正常。模型組主動脈內膜增厚明顯，不光滑，不連續，內皮細胞微絨毛缺失，大部分細胞膜缺失，細胞質外溢到管腔，只剩下少量細胞質，為祼核，內皮細胞間連接破壞，部分內皮細胞及細胞質內有許多脂滴，大小不等，呈圓形或橢圓形，電子密度不等，多數細胞膜破損、缺失，內皮細胞內線粒體大部分嵴融合或消失，粗面內質網擴張呈圓形或橢圓形，有的明顯擴張呈池狀，有嚴重脫顆粒現象，吞飲小泡明顯減少，幾乎看不到，內皮下間隙寬窄不一，SMC遷入內皮下間隙。低劑量組主動脈超微結構與模型組相似，無顯著改善。中劑量組、高劑量組及西藥組主動脈內膜增厚明顯減輕，內皮細胞較完整，細胞間連接尚可，內皮下間隙較小，均勻一致，偶可見少量脂滴，內彈力板尚連續；SMC向內皮下遷移明顯減少。

3.3 各組大鼠主動脈壁ABCA1的表達和半定量分析 結果見表2、圖2。單純從染色分數數值上來看，速效救心丸低、中、高劑量組ABCA1表達均有所上升，與模型組相比，低、中劑量差異沒有統計學意義（P＞0.05），而高劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。而阿托伐他汀降低ABCA1的表達，與模型組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。

4 討論

AS的病因及發病機制雖尚未完全闡明，但脂肪代謝紊亂所致的高脂血癥已被公認為是AS發病的重要危險因素。高脂血癥可致內皮細胞損傷或灶狀脫落，導致血管壁通透性增高，血漿脂蛋白進入內膜，引起巨噬細胞的消除反應和平滑肌細胞增殖，從而促進AS的形成[2]。故調節血脂對于抗AS有著重要的意義。

中醫學中并沒有AS之稱，但從其所表現的癥狀可將其歸于中醫中“胸痹”、“真心痛”等病證的范疇。中醫學認為本病病位在脈，與心密切相關，血脈瘀阻是其基本病理特征，因此活血化瘀成為中醫治療AS的主要方法。速效救心丸由川芎、冰片等藥物組成，川芎辛溫，入肝膽經，為血中氣藥，能“上行頭目”，“下行血海”，具有祛風止痛，行氣開郁，活血化瘀的功效，且秉升散之性；冰片辛苦、涼，入心肺經，“性善走竄開竅，無往不達”，具有行氣活血，通竅止痛之功效。川芎、冰片兩藥合用，性味歸經相互配合，相得益彰，具有活血化瘀，行氣止痛的功效。問世20余年來，大量藥理實驗證明速效救心丸具有改善微循環、保護心肌細胞和血管內皮細胞等作用。臨床主要用于治療冠心病、心絞痛、高血壓等心腦血管疾病及急性腹痛等各種痛證，長期使用，能明顯改善心功能，降低心絞痛發作[3]。藥理實驗發現速效救心丸的有效成份川芎/川芎嗪能明顯降低實驗性AS家兔及載脂蛋白E缺陷（ApoE-/-）小鼠血清TG、TC水平，有效改善主動脈AS病變[4-6]。

表1 藥物對各組大鼠血清中血脂及脂蛋白的影響（x±s）Tab.1 Effects of medicine on serum lipids and lipoproteins of rats in each group（x±s）mmol/L

圖1 各組AS大鼠主動脈透射電子顯微鏡結果Fig.1 Electron microscope examination of rats in each group

表2 各組大鼠主動脈ABCA1染色分數（x±s）Tab.2 Stain score of ABCA1 on aorta of rats in each group（x±s） 分

在以往研究的基礎上，本次實驗觀察了速效救心丸不同劑量預防性給藥后，對于AS大鼠血脂水平的影響。其中以速效救心丸高劑量調脂作用更為明顯。阿托伐他汀是選擇性競爭HMG-COA還原酶抑制劑，具有良好的調脂作用。經過大規模的臨床試驗表明，他汀類藥物在有或沒有冠心病的患者可顯著減少心血管相關的發病率和死亡率[7]。目前他汀類藥物已成為抗AS的一線用藥。速效救心丸高劑量的調脂作用與阿托伐他汀作用沒有明顯差異（P＞0.05）。病理形態學觀察亦發現速效救心丸中、高劑量和阿托伐他汀，能夠逆轉AS的病理變化，對于內皮細胞的損傷，平滑肌細胞的增殖和遷移均有良好的抑制作用。

圖2 各組大鼠主動脈ABCA1表達結果(×200)Fig.2 Expression of ABCA1 on aorta in each group of rats(×200)

ABCA1是ABC轉運體超家族成員之一，其在膽固醇的逆向轉運、膽固醇代謝以及高密度脂蛋白代謝過程中起著極其重要的調節作用，被稱為膽固醇逆轉運的守門人。肝X受體（LXR）與視黃酸X受體（RXR）是核激素受體蛋白質超家族成員，兩者可結合形成LXR/RXR異二聚體轉移到ABCA1基因啟動子的識別序列DR-4上，從而誘導ABCA1基因的轉錄，是ABCA1表達的天然調控因子。陽性對照組阿托伐他汀組與速效救心丸高劑量組降脂效果沒有明顯差異，但阿托伐他汀組對大鼠主動脈ABCA1表達并無明顯影響。有研究表明，他汀類藥物可以抑制氧化類固醇的合成，氧化類固醇正是LXRα的重要配體，在與LXRα結合后，可促進ABCA1基因的轉錄。他汀類藥物正是通過抑制LXRα氧化類固醇配體的合成，間接抑制LXR靶基因ABCA1的表達，從而抑制膽固醇的外流[8－9]。Zanotti等[10]研究發現他汀類藥物僅僅通過cpt-cAMP誘導ABCA1表達的條件下，才能抑制ABCA1介導的膽固醇和磷脂的外流。Argmann等[11]卻發現他汀藥物可以增強LXR/RXR的活性，增強ABCA1的表達，促進細胞內膽固醇的外流。上述幾項研究的實驗材料、方法及他汀類藥物均有所不同，Zanotti等[10]認為這可能與甲羥戊酸衍生物對ABCA1活性的雙相效應有關，一方面，他汀類藥物誘導的作為強效LXRα激動劑，24，25－環氧膽固醇的消耗活化了LXR途徑的ABCA1，另一方面，他汀類藥物導致的甲羥戊酸合成的類異戊二烯產物的消耗，致使ABCA1阻抑途徑的抑制。因此目前他汀類藥物對LXR途徑的最終效應尚不清楚，Qiu等[12]推斷他汀類藥物對LXR途徑的作用可能是通過依賴細胞內甲羧戊酸途徑中類異戊二烯和非異戊二烯的平衡或其他途徑而實現的。ABCA1的功能及其通路非常復雜，他汀類藥物對ABCA1的作用及通過何種途徑調節ABCA1需要更深入的研究。本實驗中觀察到速效救心丸高劑量可以誘導ABCA1轉運體的表達，從而促進膽固醇逆轉運過程的進行，提高血漿中HDL的水平，降低外周組織和血液中LDL和膽固醇的水平，從而減輕主動脈粥樣硬化病理改變。但速效救心丸中劑量亦能夠降低血清中TC、TG、LDL水平，升高HDL含量，改善主動脈病理變化，但其主動脈ABCA1表達與模型組相比，差異并不明顯，可見速效救心丸是通過多途徑、多靶點來調節脂質代謝紊亂的，其通過何種途徑調節ABCA1的表達，發揮調節血脂，抗AS的作用，仍需進一步研究探索。

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