慢病毒敲減質粒pLKO.1-hSRF 的構建及鑒定

蔡藝煌，鄧小玲，黃文霞，黃潔，紀晴， *，許銘炎，*

（1．廈門醫學院口腔系，廈門醫學院附屬口腔醫院，福建廈門361002；2．廈門大學醫學院基礎部，福建廈門361002）

當今世界，癌癥已成為嚴重威脅人類健康的重大疾病之一。在所有惡性腫瘤中，口腔惡性腫瘤占比約為3%，其中口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)則占90%[1]，并且其發病率在年輕群體中(小于40歲)呈現增加趨勢[2]。在中國臺灣地區，口腔癌位列男性癌癥死亡第4位，而咀嚼檳榔是引發口腔癌的重要因素之一，其中每年每10萬人就有6人死于口腔癌[3]。此外，現代人長期高脂高蛋白及低纖維的飲食習慣容易造成消化系統的功能紊亂，進而能引起口腔內有害菌群生長，提高了口腔癌的發病率[4]。

血清應答因子(serum response factor，SRF)是一個在生物體內廣泛表達的轉錄因子，其在多種細胞和腫瘤基質中能與c-Fos/JunB、MRTFs、E-/VE-鈣黏著素/β-聯蛋白、RhoA和肌動蛋白協同作用，在平滑肌的生理調控、胚胎干細胞早期基因激活、細胞增殖、分化、遷移以及干細胞的定向和血管生成等過程中發揮重要作用[5-12]。而目前，SRF在口腔惡性腫瘤中的研究較少，本研究通過構建pLKO.1-hSRF慢病毒敲減質粒，并成功感染口腔鱗癌細胞SAS，驗證了其能在SAS細胞中敲減SRF mRNA 和 蛋白的表達水平，獲得SRF低表達口腔鱗癌細胞株，為后續口腔惡性腫瘤的研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與載體慢病毒敲減質粒pLKO.1-TRC cloning vector及293T細胞由廈門大學生命科學學院李博安教授惠贈。SAS細胞購自日本細胞庫。

1.1.2 主要試劑和儀器限制性內切酶、DNA分子量Marker、cDNA反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)；膠回收試劑盒(Omega公司)；shRNA由廈門鉑瑞生物技術有限公司合成；DNA提取試劑盒、Super Real熒光定量預混試劑、T4DNA連接酶(TransGEN Biotech公司)；RNA提取試劑盒(東盛生物)；Turbofect轉染試劑(賽默飛世爾，USA)；嘌呤霉素(Sigma，USA)。實時熒光定量PCR儀為賽默飛世爾公司7500型實時熒光定量PCR系統。

1.2 方法

1.2.1 shRNA片段設計目的shRNA片段通過Thermo Fisher公 司 RNAi網 站 https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do進行設計，獲取的核心片段序列為GCACTGATTCAGACCTGCCTCAACT，將該片段序列反向互補，以CTCGAG為loop環連接，并在頭尾兩端加上酶切位點，最終獲得如下引物序列：正向 5 ′-CCGG G CACTGATTCAGACCTGCCTCAACTC TCGAGAG TTGAGGCAGGTCTGAATCAGTGCTTTTTG-3′，反向5′-AATTCAAAAA G CACTGATTCAGACCTGCCTCAACTC TCGAGA GTTGAGGCAGGTCTGAATCAGTGC-3′(核心序列及其互補序列下劃線表示)。通過鉑瑞生物公司合成后，將獲得的片段溶解并進行退火。本研究中以CTCGAG為loop環，由于使用pLKO.1-TRC質粒系統，則以 EcoRⅠ和 A geⅠ作為插入片段的酶切位點。

1.2.2 克隆將公司合成的正反單鏈DNA片段溶解后(100μmol/L)各取2μL，加入到46μL的退火緩沖液[50 mmol/L HEPES(pH7.4)， 100mmol/L NaCl]中 進 行 退火。退火程序95℃、5min，85℃、5min，75℃、5 min，70℃、10min，37℃、20min，4℃低溫保存獲取目的片段。然后用 EcoRⅠ和 A geⅠ對2μg pLKO.1載體進行酶切，膠回收純化，然后將退火得到的目的片段稀釋200倍后用T4連接酶對酶切載體和目的片段進行連接，22℃連接40min。再將連接產物加入到stbl3感受態細胞中進行轉化，涂布到含氨芐霉素的LB固體培養基中37℃培養16~18h。挑取單菌落加入到LB液體培養基中37℃搖動培養16~18h。最后將培養好的菌液用質粒提取試劑盒進行質粒提取，并通過雙酶切進行鑒定。酶切鑒定正確的質粒送往測序公司進行測序，以對克隆質粒的序列進行判定。獲得的陽性質粒命名為pLKO.1-hSRF。

1.2.3 病毒包裝本研究中使用三質粒包裝系統，pVSV-G、pHR和新構建質粒pLKO.1-hSRF，以pLKO.1-Scramble作為陰性對照。將293T細胞接種到6 cm培養皿中培養16h左右，待細胞匯合度達80%~90%時，使用Turbofect轉染試劑將上述質粒pVSV-G、pHR、 pLKO.1-hSRF或 pLKO.1-Scramble轉 染 到 細 胞中。轉染16~18h后換液，轉染40~48h后病毒即包裝并釋放到培養基中，收取培養基，用0.45μL濾器過濾后即獲得病毒溶液，將病毒分裝到1.5mL EP管中，每管1mL，液氮速凍后置于-80℃冰箱待用。

1.2.4 病毒感染與穩定轉染細胞株的篩選將SAS細胞接種到培養皿中，待其匯合度約為40%~50%左右時，加入Polybrane及適量病毒液，3.5cm培養皿加1 mL培養基和1mL病毒液。培養24h左右換液，培養40 h左右進行傳代并加入嘌呤霉素進行篩選，SAS的嘌呤霉素篩選終濃度約為0.2μg/mL，每隔2d換一次液，以未感染病毒的細胞為對照組， 1周后無感染病毒的對照組全死亡，而感染了病毒的實驗組尚有大量細胞存活，表明SRF穩定敲減的細胞株篩選成功。對獲得的穩定轉染細胞株進行擴增和后續鑒定。

1.2.5 實時定量PCR檢驗目的基因mRNA敲減效率將感染pLKO.1-Scramble和pLKO.1-hSRF的SAS細胞接種到直徑為3.5cm培養皿中，待細胞長滿后用RL溶液(東盛生物，RNA提取試劑盒)將細胞吹散下來加到EP管中，隨后按照說明書提取出細胞RNA，然后利用反轉錄試劑盒將RNA進行反轉獲得cDNA，用SuperReal熒光定量預混試劑按照說明書與cDNA、引物及水按比例混勻后，使用ABI7500Real-time PCR儀進行擴增檢測。以 G APDH作為內參相對定量。所用引物為： S RF上游5′-CGAGATGGAGATCGGTATGGT-3′， 下 游5′-G GGTCTTCTTACCCGGCTTG-3′；GAPDH上游5′-CATCACCATCTTCCAGGAG-3′， 下 游5′-AGGC TGTTGTCATACTTCTC-3′。

1.2.6 Western blot檢驗目的基因蛋白敲減效率將感染pLKO.1-Scramble和pLKO.1-hSRF的SAS細胞接種到6cm盤中，待細胞長滿后用細胞刮將目的細胞收集到EP管中，RIPA裂解液將細胞重懸裂解并超聲破碎，離心后去上清獲得目的細胞蛋白溶液，并用BCA蛋白測定試劑盒測定濃度。制備10%聚丙烯酰胺凝膠，蛋白上樣量為40μg，電壓60V電泳40min后改為120V電泳90min，隨后利用濕轉法將凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上。用含10%脫脂牛奶的TBST對PVDF膜封閉1 h。將膜加入到一抗稀釋液中，4℃搖床孵育過夜。回收一抗，TBST漂洗3次，每次10min。加入二抗室溫搖床孵育1h。棄去二抗，TBST漂洗3次，每次10min。在暗房中利用ECL發光液系統壓片，顯影。

1.3 統計學分析

實驗所得數據以x±s表示，感染pLKO.1-hSRF的實驗組和感染pLKO.1-Scramble對照組的mRNA表達水平采用非配對Student’s t檢驗進行組間差異性檢驗，使用GraphPad Prism5統計軟件分析， α =0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 克隆質粒的獲得

空載質粒pLKO.1-TRC全長8901bp，用EcoRⅠ和AgeⅠ雙酶切后可得到7026bp和1875bp兩個片段。如圖1所示。將目的片段(7026bp)切膠回收后與退火片段用T4連接酶進行連接，涂平板，然后挑取單克隆進行后續酶切鑒定及測序。

圖1 空載質粒酶切產物瓊脂糖凝膠電泳結果

2.2 重組質粒鑒定

設計的敲減片段中，loop環CTCGAG序列為 X hoⅠ的酶切位點，同時，選取pLKO.1質粒1189bp處 K pnⅠ作為雙酶切鑒定位點，理論上可得到大小分別約為7 800bp和1200bp的片段。本實驗挑取5個陽性克隆到培養瓶中搖菌并提取質粒后，用 X hoⅠ和 K pnⅠ對提取的質粒進行酶切鑒定。電泳結果(圖2)顯示1、2、3、5質粒被酶切出兩條片段，且酶切片段大小與預期結果一致。選取酶切正確的重組質粒進行DNA測序，測序結果與所設計片段序列一致，表明慢病毒敲減質粒pLKO.1-hSRF構建成功(圖3)。

圖2 酶切鑒定結果

圖3 陽性克隆質粒測序圖

2.3 重組質粒敲減效率的驗證

2.3.1 實時定量PCR驗證結果以 G APDH為內參，檢測感染pLKO.1-Scramble和pLKO.1-hSRF的SAS細胞mRNA表達水平。如圖4所示，與Scramble對照組相比，感染pLKO.1-shSRF病毒的SAS細胞中SRF mRNA的表達量明顯降低(P<0.01)。

2.3.2 Western blot驗證結果以GAPDH為內參，檢測感染pLKO.1-Scramble和pLKO.1-hSRF的SAS細胞蛋白表達水平變化，如圖5所示，在感染pLKO.1-hSRF病毒的SAS細胞中，SRF蛋白的表達量明顯低于對照組(P<0.01)。

圖4 SAS 細 胞穩定轉染細胞株S RF mRNA 的表達情況

圖5 SAS 細 胞穩定轉染細胞株 S RF 蛋白的表達情況

3 討論

血清反應因子(SRF)是MADS-box家族中一類古老且進化保守的轉錄因子，在其N端帶有MADS結構域，該結構域能促進其蛋白二聚化并具有DNA結合能力，而MADS結構域的C端則具有與相關調控輔因子結合的結構域[13]。SRF的C端帶有一個轉錄激活結構域，該結構域能被血清激活并磷酸化[14]。SRF參與調節細胞生長、遷移、細胞骨架組織、能量代謝等有關的多種基因。理論上，SRF能通過識別被稱之為CArG-boxes的序列，進而調控所有肌動蛋白編碼基因和部分肌肉肌球蛋白重輕鏈以及對引起肌動蛋白踏車現象的相關蛋白的調控[11]。有文獻報道，SRF在器官纖維化相關基因的調控中發揮重要作用，如ACTA2[15]和CTG[16]。且越來越多的研究[17-18]表明，心肌素相關轉錄因子/血清反應因子(MRTF/SRF)途徑有望將預防纖維化的靶點治療作為靶標，在器官纖維化病變治療過程中具有較好的前景。此外，在多種腫瘤的發生發展過程中，SRF作為重要的調控因子參與其中。如前列腺癌[19]、乳腺癌[20]、胃癌[21]等。在多種癌癥中，SRF呈現出高表達且在腫瘤的轉移、侵襲以及上皮-間充質轉分化(epithelialmesenchymal transition，EMT)中充當重要的角色[22-23]。

然而，當前SRF在口腔癌中的作用并未有詳細的研究論述。我們前期研究發現，SRF對口腔鱗癌細胞中整合素的表達具有重要的調控作用，并在口腔鱗癌細胞的遷移及侵襲能力中表現出了一定的影響。整合素是主要的細胞表面受體家族，能協調細胞與細胞外基質的黏附，促進許多動態細胞 黏 附過程，如遷移、擴散和存活，進而介導幾乎所有細胞的生命過程[24]。我們猜測SRF能通過整合素介導EMT過程，進而影響口腔癌的發展。在本研究中，我們成功構建了pLKO.1-hSRF，驗證了其能夠在SAS細胞中敲減SRFmRNA和蛋白的表達水平，獲得了穩定低表達SRF的口腔鱗狀癌細胞SAS。這對后續我們進一步研究 SR F基因在口腔鱗狀細胞癌中的功能作用奠定了重要的物質基礎。

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