硒干預對DEHP暴露下SD大鼠血細胞參數的作用

楊梅，曹乾， *，寧俊康，任雪丹，王民生

（1．東南大學公共衛生學院，江蘇南京210009；2．江蘇省疾病預防控制中心，江蘇南京210009）

硒(selenium，Se)是一種人體必需微量元素，是過氧化物系統內谷胱甘肽過氧化物酶發揮酶活性所需的必要元素[1]。相關動物實驗證明，Se可以保護肝細胞免受細胞毒性損傷，具有抗氧化作用，提高實驗動物的免疫能力[2-6]。

鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)是鄰苯二甲酸酯類(phthalates acid esters，PAEs)化合物的重要成員[7-8]。由于其實用性和成本效益，DEHP常被工業上用作增塑劑和改性劑于塑料(聚氯乙烯)生產中，還是一些驅蟲劑、化妝品、食品包裝袋、醫療用品和玩具的生產原料，被認為是廣泛的環境持久性有機污染物[2，9-11]。DEHP可以通過呼吸道、消化道、皮膚接觸或醫療過程進入機體，對人體具有潛在損害。有研究證明，其毒性作用主要表現為生殖毒性、免疫毒性、遺傳毒性、神經毒性、肝腎毒性等[11-12]。

本研究通過對SD大鼠進行不同劑量DEHP染毒，同時在不同劑量染毒下 給 予1mg/kg硒干預保護，測定各組SD大鼠血細胞參數，以研究硒干預對DEHP暴露SD大鼠血細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

酵母硒(有機硒含量≥99% ，江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司提供)；DEHP(純度≥99.5%，美國Sigma公司)。ADVIA2120i型全自動五分類血細胞分析儀(德國Siemens公司)。

1.2 動物分組與染毒

選擇健康清潔級雄性SPF級SD大鼠77只，體質量70~90g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK(京)2012-0001，質量合格證編號11400700158173；飼養于屏障動物實驗室，實驗動物環境使用許可證號SYXK(蘇)2017-0031。動物實驗室溫度控制在20~26℃，濕度為40%~70%，單籠飼養。適應性飼養3d后，將受試SD大鼠按體質量隨機分為7組，即對照組、3個DEHP染毒組(分別為300、600和900mg/kg)、3個Se干預組(在3個DEHP染毒組飼料中分別添加1mg/kg酵母硒)，每組11只。DEHP和酵母硒均按相應比例均勻拌入基礎飼料中，制成顆粒飼料，將飼料以平均每日動物體質量10%的攝食量按組別給予大鼠，連續飼喂染毒90d。染毒期間，大鼠可自由飲水、攝食。

1.3 染毒前后體質量和一般情況觀察

試驗期間觀察并記錄大鼠的一般情況，如日常行為表現、中毒體征(精神亢奮、被毛蓬松、局部脫毛現象)和死亡情況等；染毒干預90d時，大鼠空腹16h后稱取最終體質量，采股靜脈血。

1.4 血細胞參數的檢測

對SD大鼠采血，用滴加EDTA抗凝劑的1.5mL EP管取SD大鼠全血1.0mL，全自動血細胞分析儀進行血細胞參數分析。檢測紅細胞數(red blood cell，RBC)、血紅蛋白含量(hemoglobin，HGB)、紅細胞壓積(hematocrit，HCT)、平均紅細胞體積(mean corpuscular volume，MCV)、平均血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)、平均細胞血紅蛋白濃度(mean cellular hemoglobin concentration，MCHC)、紅細胞體積分布寬度(red blood cell distribution width，RDW)、血紅蛋白含量分布寬度(hemoglobin content distribution width，HDW)；白細胞數(white blood cell，WBC)、中性粒細胞比例(neutrophil ratio，NEUT)、淋巴細胞比例(lymphocyteratio， LYM)、 單 核 細 胞 (monocytes，MONO)、嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)、嗜堿性粒細胞 (basophilic granulocyte， BASO)； 血 小 板 總 數(platelet，PLT)、平均血小板體積(mean platelet volume，MPV)、血小板分布寬度(platelet distribution width，PDW)、血小板壓積(plateletcrit，PCT)等指標。

1.5 統計學方法

采用SPSS18.0進行統計學分析，多組間均數比較經方差齊性檢驗后采用單因素方差分析，各實驗組與對照組用Dunnett’s法比較，所有結果用±s表示，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 硒干預對不同劑量DEHP染毒SD大鼠體質量和體征的影響

與對照組比較，600和900mg/kg DEHP染毒組SD大鼠體質量顯著下降(P<0.05或 P<0.01)，且隨著劑量的增加，體質量差異越明顯。此 2組動物均表現出精神亢奮、被毛蓬松、局部脫毛(頭頸部、四肢及腹部)等中毒體征。將實驗過程中出現上述陽性癥狀的大鼠視為中毒，結果顯示不同劑量DEHP染毒SD大鼠中毒體征差異具有統計學意義(P<0.05)。試驗期間無大鼠死亡。與相同DEHP劑量染毒組相比，1mg/kg Se+各劑量DEHP干預組大鼠體質量均明顯增加，差異均有統計學意義(P均<0.05)，且1mg/kg Se+300和600mg/kg DEHP干預組大鼠體質量與對照組相當(P均>0.05)。與相同劑量DEHP染毒組比較，1mg/kg Se+300和600 mg/kg DEHP干預組大鼠中毒體征差異有統計學意義(P均<0.05)。提示硒干預改善了300和600mg/kg DEHP染毒組大鼠的中毒癥狀。見表1。

表 1 硒干預對不同劑量DEHP 染 毒 S D大鼠體質量和中毒體征的影響(±s， n =11)

表 1 硒干預對不同劑量DEHP 染 毒 S D大鼠體質量和中毒體征的影響(±s， n =11)

與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與相同劑量DEHP染毒組相比，#P < 0.05，## P<0.01.

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2.2 硒干預對不同劑量DEHP染毒SD大鼠白細胞參數的影響

見表2。結果顯示，600和900mg/kg DEHP染毒情況下，大鼠白細胞總數顯著下降，單核細胞比例顯著升高，與對照組相比差異均具有統計學意義(P均<0.05)。1mg/kg Se+600mg/kg DEHP干預組與600mg/kg DEHP染毒組相比較，白細胞總數增加而單核細胞比例下降，差異均具有統計學意義(P均<0.05)，而與對照組相比差異均無統計學意義(P均>0.05)。

表2 硒干預對不同劑量DEHP 染 毒 S D 大 鼠白細胞參數的影響(±s， n =11)

表2 硒干預對不同劑量DEHP 染 毒 S D 大 鼠白細胞參數的影響(±s， n =11)

與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與相同劑量DEHP組相比，# P <0.05，## P<0.01.

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2.3 硒干預對不同劑量DEHP染毒SD大鼠紅細胞參數的影響

見表3。結果顯示，300、600、900mg/kg DEHP染毒大鼠平均血紅蛋白量、血紅蛋白含量分布寬度水平均顯著升高，差異均具有統計學意義(P均<0.05)。600和900 mg/kg D EHP染毒組大鼠紅細胞總數和紅細胞壓積水平顯著下降，差異均具有統計學意義(P均<0.05)。1mg/kg Se+300mg/kg DEHP干預組大鼠紅細胞壓積與對照組和DEHP染毒 組 相比，差異均有統計學意義(P<0.01)。

2.4 硒干預對不同劑量DEHP染毒SD大鼠血小板的影響

見表4。在DEHP染毒與Se干預期間，未發現大鼠各組血小板參數出現明顯差異。

3 討論

大鼠經不同劑量DEHP染毒后造成了不同程度體質量的下降和中毒體征，體質量的下降和中毒大鼠的比例具有劑量依賴性，DEHP劑量越高，體質量下降越明顯，中毒大鼠的比例越高。進行硒干預后，300和600mg/kg劑量組大鼠體質量和中毒體征比同劑量單獨DEHP染毒組有明顯改善，與對照組間差異無統計學意義，可見硒干預對低中劑量DEHP染毒大鼠具有積極的保護作用[1，6]。

白細胞是機體內的免疫細胞，具有防御和免疫的能力，參與對細菌、病毒等異物入侵時的免疫過程，白細胞各項指標的變化是機體免疫力變化的標志[13-14]。不同劑量DEHP染毒對大鼠NEUT、LYM、LUC、EOS、BASO指標未見顯著影響，在600和900 mg/kg DEHP染毒情況下，大鼠WBC顯著下降，MONO顯著升高，與對照組相比差異具有統計學意義(P<0.05)，說明中高劑量DEHP暴露可能影響大鼠機體的免疫功能，破壞白細胞產生細胞毒性[15]。進行硒干預后，Se+600mg/kg DEHP干預組大鼠WBC和MONO水平與對照組相比差異無統計學意義，而Se+900mg/kg DEHP干預組大鼠的WBC和MONO水平與對照組相比仍然存在顯著差異，可見 1mg/kg Se在高劑量染毒下干預并不能對白細胞起到保護作用，這可能是在高濃度DEHP暴露下，機體自由基產生增加，影響機體的抗氧化酶系及氧化損傷，該結果與相關研究報道結果一致[11，13]。傅晗等[14]2015年研究硒在大鼠肝臟氧化損傷中作用研究中表明，Se元素作為人體必需的微量元素具有抗氧化作用，一定劑量情況下能夠保護細胞免受染毒暴露侵害，與本研究硒的作用結果一致。本研究結果顯示一旦DEHP劑量過高，造成的氧化損傷過強，此時Se干預并不能再對白細胞起到保護作用[1]。

表3 硒的干預對不同劑量DEHP 染 毒SD 大 鼠紅細胞相關指標的影響(±s，n=11)

表3 硒的干預對不同劑量DEHP 染 毒SD 大 鼠紅細胞相關指標的影響(±s，n=11)

度；RDW：紅細胞體積分布寬度；HDW：血紅蛋白含量分布寬度.與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與相同劑量DEHP組相比， #P <0.05，##P<0.01.

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表4 硒的干預對不同劑量DEHP 染 毒 S D大鼠血小板相關指標的影響(x±s，n=11)

紅細胞是血紅鐵蛋白的重要載體，負責供給機體組織和細胞所需的氧氣，對機體的正常運行具有重要作用[12]。大鼠DEHP不同劑量染毒后紅細胞參數檢測結果顯示HGB、MCV、MCHC、HDW與對照組相比差異不顯著，各劑量DEHP染毒SD大鼠MCH、HDW水平顯著升高(P<0.05)。600和900mg/kg DEHP染毒劑量組SD大鼠RBC和HCT水平顯著下降(P<0.05)。RBC和HCT主要用來判斷有無貧血及貧血的程度，結果表明中高劑量DEHP染毒情況下機體產生貧血狀態，攜帶所需的氧氣能力也顯著下降[15-16]。進行硒干預后結果與DEHP染毒組未見顯著差異，說明硒在紅細胞受損傷的情況下并不能起到積極的保護作用[1，7，14，17]。趙春風等[12]2014年對血細胞氧化應激研究中亦證明DEHP染毒對紅細胞造成損傷。血小板的功能主要是促進止血和加速凝血，以及維護毛細血管壁完整性，在本實驗中，不同劑量的DEHP染毒組大鼠血小板相關指標未見顯著差異。說明DEHP對大鼠的凝血止血功能無顯著影響。

綜上所述，300~900mg/kg DEHP染毒會對大鼠體質量、中毒體征以及相關血細胞參數產生一定的影響，硒干預在300~600mg/kg DEHP染毒條件下對大鼠體質量、中毒體征、血細胞參數產生積極的保護作用。

[1]孫玲，屈艾，李宗蕓，等.氯化鐠對小鼠骨髓細胞DNA的損傷及硒的干預作用[J].毒理學雜志，2017，31(4)：296-300.

[2]YANG SY，ZHANG L，MIAO K K，et al.Effects of selenium intervention on chronic fluorosis-induced renal cell apoptosis in rats[J].Biol Trace Elem Res，2013，153(1/2/3)：237-242.

[3]WANG B，LIU F，DONGJ，et al.Maternal exposure to environmental DEHP exacerbated OVA-induced asthmatic responses in rat offspring[J].Sci Total Environ，2018，615(1)：253-261.

[4]李曉麗，何萬領，文鳳云，等.酵母硒對蛋雞血清酶活性及抗氧化能力的影響[J].中國獸醫學報，2017，37(2)：318-321.

[5]周慶彪，劉穎，孔德欽，等.硒對慢性鎘暴露致大鼠腎損傷的保護作用與機制[J]. 癌 變·畸變·突變，2018，30(1)：1-7.

[6]王佳，董四君.鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)毒理與健康效應研究進展[J].生態毒理學報，2012，7(1)：25-34.

[7]李麗萍，黃凌燕，張亞娟，等.DEHP低劑量慢性暴露對雌性大鼠糖代謝的影響[J].環境與職業醫學，2017，34(8)：669-675.

[8]徐縉.DEHP對青春期大鼠糖代謝的影響及其機制[D].長春：吉林大學，2017.

[9]李諾，任雪丹，呂中明，等.DEHP亞慢性暴露對大鼠精子運動參數影響[J].中國公共衛生，2017，33(4)：611-613.

[10]唐嘯.DEHP通過氧化應激和Fasl途徑誘導GC-2spd細胞凋亡[D].武漢：武漢科技大學，2016.

[11]章子貴，許曉路，申秀英.不同硒水平對大鼠免疫力和血細胞的影響[J].微量元素與健康研究，2005，2(2)：1-2.

[12]趙春風，刁曉平，謝嘉，等.鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對馬氏珠母貝(Pinctada martensi)血細胞免疫功能及氧化應激效應的影響[J].生態毒理學報，2014，9(2)：375-381.

[13]董晉，董新文，趙躍，等.長期暴露的鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯在雌性大鼠體內的代謝及對肝臟的影響[J].癌變·畸變· 突變，2017，29(3)：211-215.

[14]傅晗，劉穎，劉江正，等.硒對鎘暴露大鼠肝臟氧化損傷的保護作用及機制研究[J].癌變· 畸變· 突變，2015，27(2)：95-100.

[15]逯曉波，于濤，馬明月，等.鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯對大鼠睪丸發育及StAR、CYP19a1、CYP11a1基因表達的影響[J].衛生研究，2010，39(3)：263-267.

[16]郭詠梅，張博綦，閆素梅，等.硒對脂多糖誘導的奶牛乳腺上皮細胞氧化損傷的保護作用[J].動物營養學報，2017，29(9)：3375-3384.