小貫小綠葉蟬半胱氨酸蛋白酶基因的克隆與表達(dá)

于永晨，肖斌，孫曉玲

1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州310008；3. 農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008

半胱氨酸蛋白酶（Cysteine protease，CYP）廣泛分布于植物、動物、病原微生物、寄生線蟲和哺乳動物等生物體內(nèi)，是一類以半胱氨酸殘基為活性中心的蛋白水解酶，可參與細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)水解與加工、組織再生、個體發(fā)育、免疫防御，以及細(xì)胞凋亡等許多生理過程[1-3]。在植食性昆蟲體內(nèi)，CYP是不可或缺的重要水解蛋白之一，主要參與食物消化、生長發(fā)育、生殖、蛻皮變態(tài)、免疫調(diào)節(jié)和種群防御等重要生命過程，目前在鱗翅目和鞘翅目等完全變態(tài)發(fā)育的昆蟲中研究得已較為透徹[4-9]。例如，家蠶（Bombyx mori）中已報道了 13條 CYP基因全長序列，它們在不同組織和不同發(fā)育時期的表達(dá)譜也已明確，進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)CYP不僅參與了家蠶蛻皮與變態(tài)過程中的組織降解與重構(gòu)，而且也參與了家蠶血細(xì)胞發(fā)育或輔助血細(xì)胞執(zhí)行造血功能等生理過程[10-14]。Peter等[15]從馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineataSay）中克隆獲得了兩條與消化相關(guān)的 CYP基因全長序列，并發(fā)現(xiàn)其中一條可被植物的誘導(dǎo)防御上調(diào)。棉鈴蟲（Helicoverpa armigeraHübner）CYP不僅參與 5~6齡幼蟲的蛻皮過程，而且參與胚胎發(fā)育過程中卵黃蛋白的降解[6-7]。迄今，關(guān)于不完全變態(tài)發(fā)育昆蟲CYP的研究僅在豆長管蚜（Acyrthosiphon pisum）等個別昆蟲中有少量報道[4]。

小貫小綠葉蟬（Empoasca onukiiMatsuda）的發(fā)育類型為不完全變態(tài)，以成蟲、若蟲刺吸茶樹芽、葉及嫩梢汁液為害，是我國茶園的頭號害蟲。雌成蟲陸續(xù)孕卵和分批產(chǎn)卵的習(xí)性導(dǎo)致其在田間世代重疊嚴(yán)重而難于防治，據(jù)統(tǒng)計，小貫小綠葉蟬大爆發(fā)可引起 30%~50%的茶葉產(chǎn)量損失，為害葉制成茶葉后品質(zhì)嚴(yán)重下降[16]。長期以來，對小貫小綠葉蟬的有效防治主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥。然而，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用導(dǎo)致的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、害蟲抗藥性等問題日益凸顯。王念武等[17]和莊家祥等[18]的研究結(jié)果表明，福建福安茶場的小貫小綠葉蟬對吡蟲啉、啶蟲脒和聯(lián)苯菊酯的抗性指數(shù)已達(dá)到中抗至高抗的水平。因此，利用新型抗蟲分子標(biāo)靶開發(fā)小貫小綠葉蟬的調(diào)控劑已成為當(dāng)務(wù)之急。如前所述，CYP在昆蟲的整個生命過程中發(fā)揮著重要作用，因此干擾半胱氨酸蛋白酶的生理功能，將會對目標(biāo)害蟲的生理機(jī)能造成嚴(yán)重阻礙，并最終導(dǎo)致死亡。目前，CYP已作為靶蛋白在一些鱗翅目昆蟲進(jìn)行了相關(guān)研究[19]。本文從小貫小綠葉蟬的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得CYP的基因片段的轉(zhuǎn)錄本序列，利用RACE技術(shù)對其全長進(jìn)行克隆，繼而采用熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對Eocyp在小貫小綠葉蟬的不同發(fā)育時期、不同組織部位，以及不同溫度和不同光照條件處理后的表達(dá)量變化情況進(jìn)行研究，擬為該基因的利用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與樣品采集

小貫小綠葉蟬成蟲捕于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗茶場，并在網(wǎng)籠中用離體茶枝飼喂[(25±2)℃，(70±5)%，14L︰10D]。繁殖一代后用于實驗。不同發(fā)育時期（5個不同齡期若蟲及雌、雄成蟲）及不同部位（頭、胸、腹）的樣品在體視顯微鏡（SZ60，奧林巴斯，日本）下進(jìn)行采集。選取 5齡新羽化若蟲，分別于 4、26、36℃下飼養(yǎng) 1 h，并于26℃下恢復(fù)1 h后采集，作為不同溫度處理的樣品備用。選取 4齡新生若蟲，分別于不同光照時間（0L︰24D，14L︰10D，24L︰0D）下飼養(yǎng)2 d后采集，作為不同光照處理的樣品備用。上述樣品均保存于–80℃冰箱中。每個處理3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 總RNA提取與cDNA的合成

使用 Promega總 RNA提取試劑盒（SV Total RNA Isolation System，Progema）提取總RNA。使用NANODROP 2000c測定RNA的濃度及質(zhì)量。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript? RT Master Mix，TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA 第一鏈。利用 SMARTer?RACE 5′/3′ Kit（TaKaRa）試劑盒進(jìn)行 RACE所用cDNA的合成。

1.3 Eocyp基因序列全長克隆

根據(jù)本實驗室小貫小綠葉蟬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到 1個小貫小綠葉蟬半胱氨酸蛋白酶基因片段轉(zhuǎn)錄本序列，根據(jù)此序列分別設(shè)計RACE引物（表1），以RACE所用cDNA為模板進(jìn)行 PCR，反應(yīng)體系為：2×PrimerSTAR Max Premix（ TaKaRa, Tokyo, Japan） 20 μL ，10×Universal Primer A Mix（UPM）4 μL，5′或 3′基因特異引物（GSP）1 μL，cDNA模板1 μL，補充ddH2O至40 μL?？寺〔捎贸彩絇CR技術(shù)，反應(yīng)條件為：94℃變性 30 s，68℃退火30 s，72℃延伸90 s，25個循環(huán)。之后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化與回收，并以PMD-19T為載體進(jìn)行連接，成功轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后委托南京金斯銳科技有限公司進(jìn)行測序。將測序得到的結(jié)果使用 DNAman進(jìn)行序列拼接，獲得全長后對其開放閱讀框（ORF）設(shè)計引物（表1），進(jìn)行 PCR重復(fù)上述實驗步驟，驗證所獲得的全長序列。

1.4 生物信息學(xué)分析

推導(dǎo)得到的氨基酸序列在 NCBI上進(jìn)行同源比對（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）；利用ProtParam（http://web.expasy.org/ protparam）進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)預(yù)測，利用 ScanProsite（http://prosite.expasy.org/prosite.html）預(yù)測蛋白功能結(jié)構(gòu)域；利用SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進(jìn)行信號肽的預(yù)測；利用DNAman進(jìn)行多序列比對；使用MEGA7軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支重復(fù)檢驗次數(shù)均為1 000。

1.5 小貫小綠葉蟬Eocyp表達(dá)特征分析

使用 FastStart Essential DNA Green Master（Roche）試劑盒進(jìn)行熒光定量分析。定量檢測引物詳見表1，以小貫小綠葉蟬18 S基因為內(nèi)參基因。相對表達(dá)量通過 2-ΔΔCT法進(jìn)行計算。利用SPSS 22.0軟件，采用單因素方差分析法對差異顯著性進(jìn)行分析。

表1 引物信息Table 1 Information of Primers

2 結(jié)果與分析

2.1 Eocyp基因克隆、序列驗證及分析

利用 RACE技術(shù)對Eocyp（GenBank登錄號：MH036890）的 3′和 5′端進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到800 bp和1 600 bp左右（圖1）的特異性條帶，使用DNAman軟件將測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接得到長為 2 144 bp的cDNA序列，根據(jù)拼接序列設(shè)計引物（表1）擴(kuò)增出1條1 772 bp的片段（圖1）。該片段包含 ORF 1 656 bp（圖2），編碼 551個氨基酸，具有由24個氨基酸殘基組成的信號肽。預(yù)測其分子式為 C2782H4163N737O835S25；相對分子量為 62 094.59；理論等電點為 6.02；不穩(wěn)定系數(shù)為 36.10，表明該蛋白狀態(tài)穩(wěn)定；總平均親水系數(shù)為–0.493，表明該蛋白為疏水性蛋白。由MotifScan分析表明，該蛋白具有半胱氨酸蛋白酶基因的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，即半胱氨酸活性位點 Cys357（351~362 QSVCGS CWSFGT），組氨酸活性位點 His499（497~507 LDHAVLLVGYG）和天冬酰胺活性位點 Asn519（514~533 YWLVKNSW SNYWGNDGYILM），同時具有GCDGG簇等保守結(jié)構(gòu)域。

圖1 Eocyp基因RACE克隆及全長驗證Fig. 1 RACE and full-length cDNA clone of Eocyp

2.2 Eocyp基因進(jìn)化樹分析

將Eocyp編碼的氨基酸序列在 GenBank中進(jìn)行檢索，并與其他已登錄的昆蟲Cyp序列進(jìn)行比對，通過MEGA7軟件采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明（圖 3），小貫小綠葉蟬Eocyp與半翅目昆蟲茶翅蝽（H. halys）和溫帶臭蟲（Cimex lectularius）聚為一支，膜翅目昆蟲小蜜蜂（Apis florea），北美大黃蜂（Bombus impatiens）等聚為一支。等翅目昆蟲古白蟻（Zootermopsis nevadensis）單獨聚為一支，而鞘翅目昆蟲（Nicrophorus vespilloides）與雙翅目果蠅屬等昆蟲聚為一支。

2.3 Eocyp基因在不同發(fā)育時期的表達(dá)分析

Eocyp基因在小貫小綠葉蟬不同發(fā)育時期的表達(dá)結(jié)果詳見圖4。結(jié)果表明，Eocyp在小貫小綠葉蟬所有發(fā)育時期均有表達(dá)，從若蟲到成蟲的發(fā)育過程中，Eocyp的表達(dá)量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，5齡若蟲表達(dá)量顯著高于其他齡期，而 1齡若蟲和雄成蟲表達(dá)量最低，顯著低于其他若蟲生長階段。由此推測Eocyp基因可能在小貫小綠葉蟬的若蟲發(fā)育階段發(fā)揮作用。

圖2 小貫小綠葉蟬Eocyp基因的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 The cDNA and deduced amino acid sequence of Eocyp in E. onukii

2.4 Eocyp基因在不同部位的表達(dá)分析

Eocyp在小貫小綠葉蟬雌成蟲頭部的表達(dá)量顯著低于胸部和腹部（圖5-A），而Eocyp在雄成蟲胸部的表達(dá)量顯著低于頭部和腹部（圖5-B）。

2.5 光照和溫度對Eocyp基因表達(dá)量的影響

不同溫度和不同光照處理對Eocyp的相對表達(dá)量都沒有顯著影響（圖6）。

3 討論

圖3 Eocyp系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of Eocyp

圖4 Eocyp在小貫小綠葉蟬不同發(fā)育階段的相對表達(dá)量Fig. 4 Relative expression levels of Eocyp in different developmental stages of E. onukii

圖5 小貫小綠葉蟬Eocyp不同部位的相對表達(dá)量Fig. 5 Relative expression levels of Eocyp in different parts of adults of E. onukii

圖6 小貫小綠葉蟬Eocyp在不同溫度（A）和不同光照（B）條件下的相對表達(dá)量Fig. 6 Expression levels of Eocyp under different temperatures (A) and different photoperiods (B)

本研究克隆到 1條小貫小綠葉蟬半胱氨酸蛋白酶基因的全長序列，命名為Eocyp，由該基因編碼的蛋白具有半胱氨酸蛋白酶基因的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)和 GCDGG簇等保守結(jié)構(gòu)域（圖 2）。將由該基因編碼的氨基酸序列與已報道的其他昆蟲半胱氨酸蛋白酶的蛋白進(jìn)行同源性比對分析，我們發(fā)現(xiàn)Eocyp與同為半翅目的茶翅蝽（Halyomorpha halys）（GenBank登錄號：XP_014283673.1）半胱氨酸蛋白酶1同源性最高為65%；與麥莖蜂（Cephus cinctus）（XP_015586901.1）、內(nèi)華達(dá)古白蟻（Zootermopsis nevadensis）（XP_021934297.1）及造紙胡蜂（Polistes dominula）（XP_015182850.1）中的 CYP同源率分別為63%、63%和61%，該結(jié)果進(jìn)一步證明我們克隆獲得的Eocyp為半胱氨酸蛋白酶基因。

Eocyp在小貫小綠葉蟬的整個發(fā)育過程中均有表達(dá)，且Eocyp在不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量存在一定差異，暗示Eocyp在葉蟬的不同發(fā)育階段可能發(fā)揮著不同的作用，這一現(xiàn)象在其他昆蟲中已見報道。例如，甘藍(lán)地種蠅（Delia radicum）的半胱氨酸蛋白酶DrCP1在幼蟲向蛹轉(zhuǎn)化時期的表達(dá)量顯著升高，說明該基因可能與幼蟲變態(tài)化蛹有關(guān)[7]。有研究發(fā)現(xiàn)橘小實蠅Bdcyp在不同發(fā)育階段皆有表達(dá)，但是主要集中在蛹期，由此推測Bdcyp在其變態(tài)發(fā)育過程中可能具有重要作用[20]。與之相似，本研究發(fā)現(xiàn)Eocyp的表達(dá)量由 1齡若蟲發(fā)育到 5齡若蟲的過程中逐步升高，這說明Eocyp對小貫小綠葉蟬若蟲的生長發(fā)育具有重要作用；Eocyp在5齡若蟲期的表達(dá)量顯著高于雌、雄成蟲的現(xiàn)象，說明該基因在小貫小綠葉蟬由若蟲向成蟲發(fā)育轉(zhuǎn)變的過程中亦具有重要作用。Eocyp在成蟲頭部的表達(dá)量顯著低于胸部和腹部，而Eocyp在雄成蟲胸部的表達(dá)量顯著低于頭部和腹部，這說明該基因可能在小貫小綠葉蟬不同雌、雄成蟲中具有相似且不同的功能。這與花絨寄甲（Dastarcus helophoroidesFairmaire）中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象基本一致[21]，但是Dahel caspase-1還被發(fā)現(xiàn)與老細(xì)胞凋亡和新細(xì)胞形成及成蟲衰老相關(guān)，Eocyp是否具有上述功能還需進(jìn)一步研究。但是，光照及溫度變化不影響Eocyp的相對表達(dá)量。需要說明的是，本文僅從轉(zhuǎn)錄水平上對Eocyp在小貫小綠葉蟬不同發(fā)育階段、不同組織部位，以及不同非生物脅迫處理下的表達(dá)量進(jìn)行分析，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行功能推測，但是該基因到底具有何種生物學(xué)功能尚需利用 RNAi技術(shù)進(jìn)行深入研究。

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