茶樹葉片氟亞細胞分布及其與細胞壁結合特性的研究

劉思怡，朱曉靜，房峰祥，張豪杰，邱安東，陳玉瓊

華中農業(yè)大學園藝林學學院/園藝植物生物學教育部重點實驗室，湖北 武漢, 430070

氟是人和動物必需的微量元素，適量的氟攝入可以促進哺乳動物骨骼中的磷酸鈣轉化為磷灰石，有利于防止齲齒和骨質變形癥等[1-2]，但是過量攝入氟會造成軟組織硬化，干擾人體鈣代謝和骨組織中膠原蛋白合成等[1-4]。茶樹（Camellia sinensis）是富集氟能力較強的幾種植物之一，葉片是茶樹富集氟的主要器官，飲茶成為人們攝入氟的渠道之一，因此，茶氟安全也備受人們的關注。茶葉中氟含量受品種、栽培環(huán)境、葉片成熟度等多種因素的影響[5-6]。自然生長狀態(tài)下，茶樹葉片富集氟的量從幾十至 1 000 mg·kg-1以上而未表現(xiàn)出中毒癥狀，是生長于同一地點其他植物的10~100倍[7-8]，表明茶樹對氟有極強的調節(jié)能力。已有研究表明，植物超富集某種元素的能力與其對超富集元素在細胞和亞細胞水平上的區(qū)隔化密切相關[9]。李剛等[10]研究發(fā)現(xiàn)，小麥根系上的 77% Al吸附于細胞壁上。FeiBo研究表明，大麥中Cd主要分布在根或枝梢細胞壁及可溶性組分里[11]。李春雷、蔡薈梅等研究發(fā)現(xiàn)，水培條件下的茶樹幼苗在氟脅迫下，茶樹葉片氟含量隨培養(yǎng)液氟濃度增加而增加，其中細胞壁和可溶性部分是葉片氟主要的存儲部位[12-13]。而在自然生長條件下，茶樹葉片氟的富集部位及其亞細胞分布是否具有同樣規(guī)律？細胞壁作為結合氟的重要部位，其結合氟的可能機理是什么？對此，本文分析了同一生長條件下3個具有不同聚氟能力的茶樹品種氟的亞細胞分布及氟與細胞壁的結合特點，以期為明確茶樹富氟的機理，為健康飲茶及茶樹低氟品種的選育提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茶葉原料：鮮葉采自華中農業(yè)大學茶園的烏牛早（WNZ）、福鼎大白（FD）、福云 6號（FY No.6）品種的成熟葉片，采回的鮮葉經(jīng)蒸餾水洗凈后晾干，–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗所用Trisbase（三羥甲基氨基甲烷）、果膠酶（CalBio M0002）、纖維素酶均購置于Biosharp公司；DTE（二硫赤鮮醇）購置于北京索萊寶科技有限公司；CDTA（反式-1,2-環(huán)己二胺四乙酸）購置于成都市科龍化工試劑廠；高氯酸，過氧化氫，咪唑，鹽酸羥胺，蔗糖等其他化學試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1亞細胞組分分離

亞細胞組分采用差速離心法[11]。稱取一定量新鮮葉片，加入預冷過的緩沖液（50 mmol·L-1Tris-HCl，250 mmol·L-1蔗 糖 ， 1.0 mmol·L-1DTE ， 5.0 mmol·L-1抗 壞 血 酸（pH7.5），料液比 1︰40（g·mL-1），研磨勻漿。勻漿過100 μm尼龍網(wǎng)，濾渣用緩沖液淋洗2次，濾渣為細胞壁組分（F1）。上清液在4 500 r·min-1下離心 15 min，沉淀為細胞核和葉綠體組分（F2）。收集離心后的上清液在15 000 r·min-1下離心 35 min，沉淀為線粒體組分（F3），上清液為含核糖體的可溶性組分（F4），所有操作均在4℃下進行，冷凍干燥得所需樣品。

1.2.2 細胞壁組分分離

參照文獻[14]的方法。取 1.2.1中所得細胞壁組分，用預冷磷酸緩沖（pH7.0）淋洗殘渣（料液比1︰100，g·mL-1），除去水溶性物質。然后用–20℃預冷丙酮（1︰50，g·mL-1）淋洗除去脂溶性物質，再用少量緩沖液淋洗，抽干，最后用 LiCl（3 mol·L-1，檸檬酸-磷酸緩沖液配制，pH5.5，）4℃下浸泡24 h（料液比 1︰10，g·mL-1），除去蛋白質，抽干，殘余物冷凍干燥。

取適量上述樣品于離心管，按料液比1︰40（g·mL-1）加入 0.5 mol·L-1咪唑溶液（pH 7.0），在 25℃下振蕩提取 24 h，5 000 r·min-1離心20 min，沉淀物用咪唑溶液洗滌2~3次，合并上清液，冷凍干燥得螯合態(tài)果膠（CW-P1）；沉淀物加入 50 mmol·L-1Na2CO3（內含 20 mmol·L-1CDTA），按上述同樣條件，離心后的上清液冷凍干燥即為堿溶性果膠（CW-P2）；沉淀物用4 mol·L-1KOH按同樣條件提取，離心后的上清液用 4 mol·L-1HCl中和至 pH5.0，冷凍干燥即為半纖維素（CW-HC）；殘渣冷凍干燥即為纖維素（CW-C）。

1.2.3 細胞壁化學改性

參照文獻[15]的方法。將茶樹鮮葉按 1︰10（g·mL-1）加入-20℃預冷 75%乙醇溶液勻漿，5 000 r·min-1離心，沉淀用預冷75%乙醇溶液浸提 2次，每次于 4℃下 5 000 r·min-1離心 10 min。沉淀物依次用預冷的丙酮、甲醇-三氯甲烷混合液（l︰l，V/V）和甲醇溶液進行洗滌，沉淀物冷凍干燥即為細胞壁，液氮磨碎，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

細胞壁甲基化改性：稱取2 g細胞壁于錐形瓶中，加入80 mL甲酸和40 mL甲醛，置于25℃恒溫搖床振蕩反應6 h，振蕩轉速125 r·min-1。反應結束后離心分離，沉淀物用去離子水沖洗3次，得到經(jīng)甲基化改性處理后的細胞壁，冷凍干燥后，4℃保存?zhèn)溆谩φ战M用相應量的純水代替甲酸、甲醛，其余處理同改性組。

細胞壁酯化改性：稱取2 g細胞壁于錐形瓶中，先加入140 mL無水甲醇，再加入1.2 mL濃 HCl。懸浮液在 125 r·min-1下振蕩 12 h，離心后沉淀物用去離子水洗滌3次，冷凍干燥后4℃保存?zhèn)溆谩φ战M用相應量的純水代替甲醇和濃鹽酸，其余步驟同處理組。

1.2.4 果膠酶、纖維素酶酶解

果膠酶酶解：取2 g細胞壁于錐形瓶中，加入120 mL l%果膠酶及0.1% BSA（檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制，pH3.5）。混合均勻后在50℃水浴中酶解2 h，離心分離沉淀，去離子水洗滌3次，冷凍干燥后4℃保存?zhèn)溆谩φ战M用相應量失活的果膠酶和BSA處理。

纖維素酶酶解：取 2 g細胞壁于錐形瓶中，加入120 mL l%纖維素酶及0.1% BSA（檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制，pH 5.0）。混合均勻后在 50℃水浴中酶解 2 h，離心分離沉淀，去離子水洗滌3次，冷凍干燥后4℃保存?zhèn)溆谩φ战M用相應量失活的纖維素酶和BSA處理。

1.2.5 氟的測定

氟含量測定：采用堿熔灰化-氟電極測定，參照文獻[16]。

不同組分氟所占細胞壁總氟的百分含量換算方法：（不同組分氟含量×該組分的質量）/細胞壁總氟量。

1.2.6 金屬離子含量

準確稱取樣品0.1 g于錐形瓶中，加10 mL混合酸（V硝酸︰V高氯酸=4︰1），置于電熱板上慢慢升溫加熱至 140~180℃，使黃棕色煙（NO2）慢慢揮發(fā)，再適當提高溫度繼續(xù)消化，消化至消化液呈無色透明，冷卻至室溫后將消化液過濾，轉移至 25 mL容量瓶，超純水定容。火焰-原子吸收分光光度計測定金屬離子含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)表示為3次重復的平均值±標準差。采用 SPSS（17.0）軟件進行數(shù)據(jù)分析處理，最小顯著差數(shù)法（LSD法）進行多重比較分析。以百分數(shù)為單位的數(shù)據(jù)先做平方根反正弦轉換后再進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 茶樹葉片氟的亞細胞分布

從圖1~2可以看出，茶樹葉片亞細胞組分中氟含量存在顯著差異（P<0.05），3個品種的細胞壁組分氟含量都最高，烏牛早、福云6號和福鼎大白細胞壁氟含量分別為2 676.94、2 225.42、1 854.79 mg·kg-1，占葉片總氟的39.74%、50.63%和 56.42%。其次是細胞核和葉綠體組分，含量分別為1 037.51、756.54、750.80 mg·kg-1，占葉片總氟的 15.59%、14.68%和 21.54%。可溶性組分氟含量最低，分別為320.74、244.89、288.41 mg·kg-1，但由于該組分在細胞中的總量較高，因此，其所含的氟總量占葉片總氟的31.35%、28.35%和37.32%，僅次于細胞壁組分。線粒體組分中氟含量分別為 686.93、457.63、395.82 mg·kg-1，所含氟總量僅為葉片氟總量的0.55%，1.39%和2.43%，氟分布量最少。

2.2 氟在細胞壁各組分中的分布

細胞壁中累積了大量氟，進一步分離褔云6號細胞壁組分，分析葉片細胞壁組分氟含量分布。結果表明，細胞壁各組分對氟的富集能力差異顯著（圖3~4）。螯合態(tài)果膠組分氟含量最高，為 1 400.14 mg·kg-1，占細胞壁總氟的 38.58%；其次為堿溶性果膠，氟含量為1091.47 mg·kg-1，但由于該組分在細胞壁中的總量較少，因此其所含的氟僅占細胞壁總氟的16.86%；半纖維素氟含量為 241.91 mg·kg-1，占細胞壁總氟的36.60%；纖維素氟含量最低，為 167.68 mg·kg-1，顯著低于其他組分中氟含量（P＜0.05），占細胞壁總氟的7.96%。

圖1 氟在茶樹葉片中的亞細胞分布Fig. 1 Subcellular distribution of F in tea leaves

圖2 茶樹葉片中氟亞細胞分布的相對比例Fig. 2 Relative F percentages in subcellular fractions of tea leaves

圖3 氟在茶樹葉片細胞壁各組分的分布Fig. 3 F distribution in cell wall fractions

圖4 茶樹葉片細胞壁各組分中氟分布的相對比例Fig. 4 Relative F percentages in cell wall fractions

2.3 細胞壁結構變化對結合氟的影響

為探究葉片細胞壁結構變化對結合氟的影響，對葉片細胞壁進行了甲基化、酯化改性和酶解處理。結果（圖5）表明，細胞壁甲基化和酯化后氟含量顯著降低，比對照分別降低55.82%和 27.54%，細胞壁分別經(jīng)纖維素酶和果膠酶處理后氟含量的變化和對照處理差異均不顯著。說明，細胞壁中基團發(fā)生改變，對結合氟影響較大；而細胞壁中纖維素和果膠分子鏈大小對細胞壁結合氟的作用影響不明顯。

2.4 細胞壁金屬離子對結合氟的影響

2.4.1 細胞壁組分金屬離子含量

由試驗結果（表1）可以看出，茶樹葉片細胞壁組分中 F與 Ca2+、Mn2+和 Al3+具有顯著正相關，相關性系數(shù)分別為 0.749、0.841和 0.844，提示這幾種金屬元素可能對細胞壁結合氟起著重要作用。

2.4.2 細胞壁改性后金屬離子及氟含量變化

茶樹葉片細胞壁經(jīng)改性后金屬離子和氟含量如圖6所示。細胞壁經(jīng)甲基化處理后，隨著氟含量的降低，鎂、鐵、鈣、錳和鋁離子含量較對照組下降顯著，分別降低 82.08%、26.47%、31.27%、65.44%和 34.03%（圖 6-A）；酯化改性后鎂、鐵、鈣、錳和鋁離子含量較對照分別降低63.84%、14.71%、73.46%、62.16%和26.09%（圖6-B）。

纖維素酶酶解處理細胞壁后鎂含量顯著降低，鈣、鐵、錳和鋁金屬離子含量變化不顯著（圖6-C）；果膠酶酶解后鎂、鐵含量顯著降低，而其他元素變化不明顯（圖6-D）。

圖5 細胞壁改性后氟含量變化Fig. 5 The F content of cell wall with methylation modification

表1 細胞壁組分氟和金屬離子含量及相關系數(shù)Table 1 Correlation coefficients of F and metallic elements in subcellular fractions mg·g-1

3 討論

茶樹對氟的高耐受性及強富集性，表明茶樹體內必然存在著某種解毒機制。本文通過對茶樹葉片中氟的亞細胞分布及其與細胞壁結合特性研究，發(fā)現(xiàn)在茶樹3個品種烏牛早、福鼎大白和福云六號中，均表現(xiàn)為茶樹葉細胞壁氟（1 854.79~2 676.94 mg·kg-1）最高，占細胞氟總量的 39.74%~56.49%，其次是可溶性組分，氟含量占細胞總量28.35%~37.32%，表明細胞壁和可溶性部分是茶樹氟富集的最主要部位，這與重金屬等元素在相關抗性植物亞細胞結構中的分布規(guī)律相似[17-21]。可溶性組分包括細胞質和液泡。液泡中含有豐富蛋白質，有機酸和有機植物堿等物質，是植物積累和貯存養(yǎng)料及多種代謝產(chǎn)物的重要器官，胞質中過剩的中間產(chǎn)物可被液泡吸收和貯存，減少對酶和細胞器的傷害[22]。植物液泡對過剩物質或有毒物質的區(qū)隔化作用已被很多研究證實，如在高鋁介質中，大麥根細胞內Al3+通過Al3+/nH+交換機制貯存于液泡當中[17]；蜈蚣草羽葉胞液是砷富集的最主要部位，減少了砷對蜈蚣草的毒性作用[19]。茶樹吸收的氟一部分貯存于液泡中，可有效減少氟對細胞器的毒害作用，這可能也是茶樹耐氟的重要原因之一。植物細胞壁主要是由多糖、蛋白質和木質素等組成的一個復合體，廣泛參與植物生長發(fā)育及各種逆境脅迫響應，是重金屬離子及其他有害元素進入細胞質的第一道屏障[23]。細胞壁中的蛋白質、多糖和果膠等生物大分子含有醛基、羧基、氨基和磷酸鹽等基團結構，可提供大量離子交換位點[24-25]。

圖6 細胞壁改性后金屬離子及氟含量變化Fig. 6 The changes of metal ion and F contents in modified cell wall

本文研究表明，細胞壁中累積了葉片40%以上的氟，其中，果膠螯合的氟最多，占細胞壁氟55%以上，其次為半纖維素，占細胞壁氟36%以上。果膠和半纖維素都含有大量官能團-OH、-COOH、-CHO，可通過氫鍵、共價鍵、酯鍵、離子鍵等與蛋白質、其他糖分子、金屬離子和氟離子結合形成復雜的網(wǎng)絡共聚體，維持細胞正常生命活動。細胞壁經(jīng)甲基化和酯化處理后，氟和鎂、鐵、鈣、錳和鋁等金屬離子含量顯著減少，而果膠酶和纖維素酶處理后，除鎂、鐵外，其他離子變化不明顯，說明-COOH和-NH2可能在結合氟及金屬離子中起主要作用，而糖分子鏈長短對結合氟及金屬離子作用不明顯。通過對細胞壁中金屬離子與氟含量的相關性分析發(fā)現(xiàn)Ca2+、Mn2+和Al3+與F具有顯著正相關，推測這幾種金屬離子在細胞壁結合氟方面發(fā)揮重要作用。

綜合以上試驗結果，茶樹葉片中氟主要存在于細胞壁和可溶性組分中，細胞壁結合氟可能有兩種形式，一方面氟可能與細胞壁中的-NH2、-COOH和-OH以氫鍵形式存在，另一方面與細胞壁中的金屬離子以離子鍵結合而間接被細胞壁固定。細胞壁和液泡對氟的蓄積作用可能是茶樹免遭氟毒害的重要機制之一。

[1] 張云桂, 張昊, 朱雯. 磚茶氟的防齲功效及其應用[J]. 茶葉通訊, 2010, 37(4): 7-8.

[2] Borah K K, Bhuyan B, Sarma H P. Lead, arsenic, fluoride,and iron contamination of drinking water in the tea garden belt of darrang district, Assam, India [J]. Environmental Monitoring and Assessment, 2010, 169: 347-352.

[3] Fan Z, Gao Y, Wang W, et al. Prevalence of brick tea-type fluorosis in the tibet autonomous region [J]. Journal of Epidemiology, 2016, 26(2): 57-63.

[4] 趙平花. 茶葉氟含量的研究及對人體健康的影響分析[J].福建茶葉, 2016(2): 28-29.

[5] 陳瑞鴻, 梁月榮, 陸建良, 等. 茶樹對氟富集作用的研究[J]. 茶葉, 2002, 28(4): 187-190.

[6] 馬立鋒, 石元值, 阮建云, 等. 我國茶葉氟含量狀況研究[J]. 農業(yè)環(huán)境保護, 2002, 21(6): 537-539.

[7] 吳命燕. 茶葉氟積累特性及降氟措施研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2011.

[8] 郜紅建, 劉騰騰, 張顯晨, 等. 安徽茶園土壤氟在茶樹體內的富集與轉運特征[J]. 環(huán)境化學, 2011(8): 1462-1467.

[9] Hall J L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance [J]. Journal of Experimental Botany, 2002, 53: 1-11.

[10] 李剛, 唐劍鋒, 林咸永, 等. 小麥根尖細胞壁對鋁的吸附/解吸特性及其與耐鋁性的關系[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學報,2007, 13(2): 192-199.

[11] Wu F B, Dong J, Qian Q Q, et al. Subcellular distribution and chemical form of Cd and Cd-Zn interaction in different barley genotypes [J]. Chemosphere, 2005, 60(10): 1437-46.

[12] 李春雷. 氟對茶樹幼苗生理生化的影響及其作用機制研究[D]. 武漢: 華中農業(yè)大學, 2011.

[13] 蔡薈梅, 彭傳燚, 侯如燕, 等. 三個品種茶樹氟富集特性及其在亞細胞中的分布[J]. 中國農業(yè)科學, 2013, 46(8):1668-1675.

[14] 楊玉華, 喻敏, 杜昌文, 等. 不同硼效率油菜品種細胞壁組分中硼的分配[J]. 作物學報, 2005, 31(5): 608-611.

[15] 徐劼. 茶樹（Camellia sinensisL.）對鉛的吸收累積及耐性機制研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2011.

[16] 朱曉靜, 房峰祥, 張月華, 等. 茶葉及茶多糖中氟測定前處理方法的比較研究[J]. 茶葉科學, 2015, 35(2): 145-150

[17] Kasai M, Sasaki M, Tanakamaru S, et al. Possible involvement of abscisic acid in increases in activities of two vacuolar H+-pumps in barley roots under aluminum stress.Plant and cell physiology [J]. 1993, 34(8): 1335-1338

[18] Taylor GJ, Mcdonald-Stephens JL, Hunter DB, et al. Direct measurement of aluminum uptake and distribution in single cells ofChara coralline[J]. Plant Physiology, 2000, 123(3):987-996.

[19] 陳同斌, 閻秀蘭, 廖曉勇, 等. 蜈蚣草中砷的亞細胞分布與區(qū)隔化作用[J]. 科學通報, 2006, 50(24): 2739-2744.

[20] 王愛霞, 方炎明. 空氣重金屬元素在懸鈴木葉中的亞細胞分布及其區(qū)隔化效應[J]. 西北植物學報, 2011, 31(3):479-485.

[21] Gao H J, Zhao Q, Zhang X C, et al. Localization of fluoride and aluminum in subcellular fractions of tea leaves and roots[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014,62(10): 2313-2319.

[22] 汪良駒, 劉友良. 植物細胞中的液泡及其生理功能[J]. 植物生理學通訊, 1998, 34(5): 394-400.

[23] 劉清泉, 陳亞華, 沈振國, 等. 細胞壁在植物重金屬耐性中的作用[J]. 植物生理學報, 2014, 50(5): 605-611.

[24] Allan D, Jarrell W. Proton and copper adsorption to maize and soybean root cell walls [J]. Plant Physiol, 1989, 89(3):823-832.

[25] 劉婷婷, 彭程, 王夢, 等. 海州香薷根細胞壁對銅的吸附固定機制研究[J]. 環(huán)境科學學報, 2014, 34(2): 514-523.