秋茶光合作用與品質成分變化的分析

張蘭，魏吉鵬,2，沈晨,2，顏鵬，張麗平，李鑫*，韓文炎*

1. 中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2. 中國農業科學院研究生院，北京 100081

“春茶好，夏茶澀，秋茶好吃摘不得”。與春茶相比，夏秋茶芽葉中呈苦澀味的兒茶素、花青素等物質含量增多，氨基酸含量減少，使其苦澀味重、滋味鮮爽度差，嚴重影響茶葉品質和經濟效益[1]。夏秋季光照充足、雨水充沛，茶鮮葉產量很高，但品質差、效益低在很大程度上降低了茶農的生產積極性，許多地方夏秋茶僅少量采摘或棄之不采，造成嚴重的資源浪費[2-3]。

茶葉品質的季節性變化及地區間的適制性差異反映了環境因素對品質的影響，如光、溫度等因子不僅對茶樹生育具有十分重要的作用[4-5]，同時影響茶樹多酚類、咖啡堿及茶氨酸等品質成分的合成與代謝[6]。遮蔭覆蓋作為目前生產上提高夏秋茶品質最有效的農藝措施[7]，就是通過種植遮蔭樹或覆蓋遮陽網等措施直接改變茶樹冠層的光照、溫度等環境因子，促進茶樹生長，影響并調節茶樹生理代謝和生化過程，最終降低茶多酚含量，提高氨基酸、咖啡堿含量，改善夏秋茶品質[8-11]。另外，適度遮蔭在改善茶葉品質的同時能有效提高茶樹的凈光合速率，打破茶樹光合“午休現象”[12-13]。光合作用為茶樹碳、氮代謝提供碳源和能量[14-15]，而糖作為碳源或信號分子可能參與類黃酮生物合成的代謝調控[6]。因此，環境因子光、溫度及光合作用可能是影響夏、秋茶品質的關鍵因素。

目前關于夏秋季強光、高溫等環境因素對茶品質成分影響的研究較少，本試驗以自然生長的龍井43為材料，測定在日照強度、日平均溫度顯著不同的兩時間里，秋茶冠層處光強、葉片溫度、光合作用、主要品質成分含量及品質成分相關基因合成表達，從而初步明確光強、溫度及光合作用與秋茶品質成分之間存在的聯系，為茶葉生產者在改善夏秋茶品質方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗在中國農業科學院茶葉研究所龍冠公司茶園中進行，采用適制綠茶品種龍井 43為材料。在茶園中選擇受光均勻，無樹木遮蔽的連續3行（長度為10 m）茶樹作為試驗區。分別于2016年8月19日、9月23日（都為晴天）6時至18時每3 h測定冠層處光強，并隨機選取試驗區12片茶樹新完全展開葉（一般為第三葉）測定葉片溫度及相關光合指標；6時至21時每3 h均勻地在試驗區采集一芽二葉新梢樣，用于測定茶主要品質成分含量和品質相關合成基因表達。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 光合氣體交換

利用 LI-COR 6400xt型便攜式光合熒光測量系統在光照強度為 600 μmol·m-2·s-1、CO2濃度為 400 μmol·mol-1條件下測定茶樹冠層處新展開葉片的凈光合速率、胞間 CO2濃度、氣孔導度及蒸騰速率，同時利用外部光強探頭及葉室內葉溫熱電偶測定冠層處光強及葉片的溫度。

1.2.2 茶多酚、游離氨基酸及咖啡堿含量測定

茶多酚含量測定參照GB/T 8313—2008。游離氨基酸、咖啡堿含量測定參照GB/T 8314—2013及GB/T 8312—2013有所改進。上清液浸提方法：準確稱取1.0000 g茶粉末于50 mL錐形瓶中，加入超純水 45 mL后轉入沸水浴中，浸提45 min（每隔10 min搖動 1次）后立即趁熱減壓過濾，殘渣用熱超純水洗滌4~5次。濾液冷卻后轉入 50 mL離心管中，用超純水定容至刻度，搖勻。

游離氨基酸測定方法：吸取0.1 mL上清液于10 mL離心管中，分別加入50 μL 2%茚三酮、50 μL pH 8.0的磷酸緩沖液，沸水浴中加熱15 min后在冰水中快速冷卻，然后加入4.8 mL超純水，搖勻后在570 nm波長下測定吸光值。茶咖啡堿含量測定：準確吸取 5 mL溶液至50 mL離心管中，分別加入4 mL 0.01 mol·L-1鹽酸和2 mL 50%（w/v）的乙酸鉛溶液，然后用超純水定容至刻度，靜置澄清過濾。準確吸取濾液25 mL至50 mL離心管中，加入0.1 mL 4.5 mol·L-1硫酸溶液，加水稀釋至刻度，混勻，靜置澄清過濾。濾液在274 nm處測定吸光值。

吸光值的測定使用SHIMADZU UV-2550分光光度計。

1.2.3 茶樹總RNA提取及反轉錄

使用TIANGEN RNAprep pure Plant Kit（離心柱型）試劑盒，根據推薦步驟提取茶樹葉片的總RNA。總RNA濃度及質量的測定使用NaNoDrop2000超微量分光光度計（中國香港，Gene Company Limited）。使用ReverTra Ace qPCR RT試劑盒（日本，TOYOBO）將提取的葉片總RNA根據推薦步驟進行反轉錄，合成cDNA模板。

1.2.4 基因表達

qRT-PCR（Quantitative real time-PCR，熒光實時定量PCR）使用StepOnePlus Real-Time PCR System儀器（美國，Applied Biosystems公司）進行。20 μL 反應體系中包括 10 μL SYBR Green Master Mix熒光染料（中國，Vazyme），濃度稀釋為 10 μmol·L-1的正、反向引物各 0.4 μL，0.4 μL ROX，2 μL cDNA 模板及 6.8 μL滅菌超純水。PCR采用兩步法標準程序，反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性 10 s，65℃延伸 40 s，擴增 40個循環。基因相對表達量計算參照Livak等方法[16]。

1.2.5 數據分析

采用Excel 2010進行數據整理，SAS 8.1及SPSS 21.0統計軟件進行顯著性差異及相關性分析，Primer Premier 5.0設計引物序列，Origin 7.5作圖。

2 結果與分析

2.1 茶樹冠層光強和葉片溫度的變化

茶樹冠層葉片處的光強及葉片溫度直接受外界環境光強及空氣溫度的影響，也是直接影響茶樹新梢生長發育的關鍵因素。從6時至18時，茶樹冠層處光照強度和葉片溫度均呈先升高后降低的趨勢。8月19日及9月23日光照強度在正午 12時達到最大值，分別為1649.3、1467.7 μmol·m-2·s-1，隨后迅速下降（圖1-A）。兩者的葉片溫度在12時至15時內穩定維持當天最高值，分別約為42.8℃、34.2℃，前者最高溫比后者高約 8.6℃（圖 1-B）。通過圖1可知，8月 19日冠層處光強與葉片溫度顯著高于9月23日同一時間點的冠層處光強和葉片溫度。

2.2 茶樹冠層功能葉片光合參數的變化

光合作用是碳代謝的重要部分，植物體內的糖、淀粉等碳水化合物和氨基酸、蛋白等含氮化合物都直接或間接地來源于光合作用。此外，植物體內的碳氮代謝還需要光合作用提供能量。測定8月19日及9月23日茶樹新展開功能葉的凈光合速率發現，前者凈光合速率在6 時至 9 時最大，約為 10 μmol·m-2·s-1，其光合作用強度在12時顯著降低，至18時凈光合速率下降為 0.77 μmol·m-2·s-1；后者凈光合速率變化呈現典型的“單峰型”，峰值在上午9時，約 13.37 μmol·m-2·s-1（圖 2-A）。9 時至 18時前，后者光合作用強度顯著高于前者。不同時間點茶樹葉片的氣孔導度如圖 2-B所示，8月19日葉片氣孔導度最大值在9時至12時，約 0.11 mol·m-2·s-1；9 月23 日6~12 時，氣孔導度逐漸上升至最大值，約 0.17 mol·m-2·s-1。前者氣孔導度在15時之前顯著低于后者。圖2-C為不同時間點茶樹葉片的胞間 CO2濃度。8月19日葉片胞間CO2濃度在6時、9時、15時有最低值，12時和18時存在顯著上升；9月23日其趨勢變化較明顯，在9時、15時存在胞間 CO2濃度的當天最低值，6時、18時其濃度相對較高。8月19日和9月23日的茶樹葉片蒸騰速率在中午12時達到最大值，約為3.70 mmol·m-2·s-1，9 時、15 時前者蒸騰速率顯著高于后者（圖2-D）。

2.3 茶樹一芽二葉品質成分的變化

圖1 茶樹冠層光強和葉片溫度的變化Fig. 1 The changes of luminous intensity and leaf temperature of tea canopy

圖2 茶樹冠層功能葉片光合參數的變化Fig. 2 The changes of photosynthesis parameters of tea functional leaves

茶葉中的茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿是影響茶葉品質的主要成分，三者的含量及比例直接影響茶葉的滋味品質[17]。由圖3-A可知，8月19日6時至21時茶樹一芽二葉中茶多酚含量在 15時達到最大值，約為 32.41%，21時下降至28.59%。9月23日茶多酚含量在9時、12最高，范圍在14.94%~15.41%，21時含量下降至 12.68%。前者茶多酚含量是后者同一時間茶多酚含量1.9~2.3倍。8月19日游離氨基酸含量整體維持在2.09%~2.29%，但9月23日的含量變化幅度相對較大，不同時間點游離氨基酸含量分別為 3.93%、3.60%、3.76%、3.87%、3.96%、3.12%（圖3-B）。利用茶多酚及游離氨基酸含量的比值，獲得酚氨比（圖3-C）。結果顯示 8月 19日酚氨比維持在很高的水平，約13.27~14.75；9月23日酚氨比相對較低，范圍在 3.57~4.24。前者酚氨比是后者的3.14~4.09倍。圖3-D所示為茶葉片中咖啡堿含量，發現8月19日咖啡堿含量顯著高于9月23日。前者不同時間點咖啡堿含量分別為3.81%、2.92%、2.90%、3.00%、3.01%、2.62%，在上午 6時開始下降。后者咖啡堿含量分別為 2.37%、2.47%、2.61%、2.12%、2.09%、1.97%，在 12時達最大值后開始降低。

2.4 茶樹冠層處光強、葉片溫度與光合作用參數、品質成分含量相關性分析

將8月19日、9月23日6時至18時茶樹冠層處光強、葉片溫度、光合作用參數與品質成分含量進行相關性分析（表1）。結果表明，茶樹冠層處光強與葉片溫度顯著相關，同時影響茶樹葉片的氣孔導度、蒸騰速率及胞間 CO2濃度，相關性系數分別為 0.659、0.409、–0.597和0.885。葉片溫度與凈光合速率負相關，與蒸騰速率正相關。同時，葉片溫度與品質成分茶多酚、氨基酸含量及酚氨比分別有0.604、–0.691、0.676的顯著相關性。另外，茶樹主要品質成分含量之間也具有顯著的相關關系。茶多酚含量與酚氨比、咖啡堿含量呈顯著正相關，相關系數高達0.960、0.802；與氨基酸含量負相關，相關系數為–0.939。氨基酸含量與酚氨比、咖啡堿含量呈顯著負相關。酚氨比與咖啡堿含量顯著正相關，相關系數達0.800。

圖3 茶樹一芽二葉品質成分含量的變化Fig. 3 The changes of tea quality components in two leaves and one bud shoot

表1 茶樹冠層處光強、葉片溫度與光合參數、品質成分含量之間的相關性分析Table 1 Correlation analysis of luminous intensity, leaf temperature, net photosynthesis rate andquality component contents

2.5 茶樹冠層處光強、葉片溫度、凈光合速率與品質成分基因表達水平的相關性分析

為在轉錄水平上進一步明確光強、葉片溫度、凈光合速率是否與品質成分相關合成基因表達存在聯系，通過GenBank中登錄的有關茶多酚[18-19]、氨基酸[20-21]及咖啡堿[22]合成基因的序列信息，設計相關引物（表2）。以CsPTB為內參基因[23]，8月19日6時的表達量為對照，得到8月19日與9月23日不同時間點相關基因表達數據。利用基因表達數據與光強、葉片溫度、凈光合速率及品質成分含量進行相關性分析（表3）。

結果表明，基因CsPAL、CsCHI、CsF3′5′H、CsDFR、CsANS、CsUFGT、CsLAR的表達水平與秋茶茶多酚含量顯著相關，其中CsPAL、CsANS、CsLAR與茶多酚含量的相關系數分別為 0.603、0.469、0.425，而CsCHI、CsF3′5′H、CsDFR、CsUFGT與茶多酚含量的相關系數分別為–0.683、–0.754、–0.696、–0.870。基因CsGDH、CsGS、CsGOGAT、CsTS1及CsTS2與秋茶氨基酸含量的顯著相關系數分別為 0.559、–0.427、0.413、0.882、–0.445。基因CsTIDH、CssAMS與咖啡堿含量具有顯著相關性，相關性系數分別為–0.421、0.503。在上述基因中進一步篩選，表達量與葉片溫度顯著相關的分別是CsPAL、CsF3′5′H、CsANS、CsUFGT、CsGS、CsGOGAT及CsTS1；與光強顯著相關的是基因CsPAL、CsANS、CsGS、CsTS1、CsTS2及CssAMS；與凈光合速率顯著相關的基因是CsF3′5′H、CsANS、CsUFGT、CsGOGAT及CsTS2。

3 討論

在茶園生態系統中，光、CO2濃度、溫度、水分是影響茶樹光合作用的主要生態因子，葉片溫度、氣孔導度、胞間CO2濃度及蒸騰速率是影響茶樹光合作用的主要生理因子[24]。本研究發現，秋茶生長期典型的強光、高溫環境下，冠層處光強并不是影響秋茶凈光合速率的直接因素，而與冠層處光強有顯著相關性的葉片溫度、氣孔導度、胞間CO2濃度是影響秋茶凈光合速率的關鍵生理因子。葉片胞間CO2濃度與氣孔導度密切相關，兩者的變化共同反映出凈光合速率主要受氣孔限制還是葉肉細胞活性限制[25]。由圖2-C可知，秋茶凈光合速率的下降伴隨著胞間CO2濃度的提高，此時葉肉細胞光合活性成為秋茶光合作用的主要限制因素。因此，秋茶葉片溫度以及葉肉細胞光合活性成為影響其凈光合速率的關鍵因素。

表2 茶樹茶多酚、氨基酸、咖啡堿合成相關基因的實時熒光定量引物序列Table 2 Primer sequences of genes related to the biosynthesis of tea catechins, amino acids and caffeine for qRT-PCR

表3 茶樹品質成分合成基因表達與冠層處光強、葉片溫度及凈光合速率的相關性分析Table 3 Correlation analysis of the expressions of genes involved in quality component biosynthesis, the luminous intensity, leaf temperature and net photosynthesis rate

光、溫度不僅影響茶樹光合作用，同時也直接參與調控茶樹次生代謝途徑中一些關鍵基因的表達。李麗田[26]研究表明，光強影響茶樹兒茶素的組分含量并且多數兒茶素合成相關基因的表達受光強的影響，但不同基因對光強的響應模式不同。表3研究結果顯示，秋茶冠層處光強可能對兒茶素合成基因CsPAL、CsCHS、CsANS、CsANR存在顯著誘導作用。目前，光對氨基酸、咖啡堿代謝調控的研究報道相對較少，本研究發現，冠層處光強可能在轉錄水平調控基因CsGS、CsTS1、CsTS2及CssAMS的表達。值得注意的是，冠層處光強與秋茶茶多酚、氨基酸及咖啡堿含量沒有顯著相關性，因此，光強雖然對秋茶部分品質相關基因存在轉錄調控，但可能不是影響最終品質成分含量的關鍵因素。

有研究證明，晝夜溫度為15℃/5℃的低溫環境下，銀杏葉片中類黃酮總量，PAL、C4H及4CL活性顯著提高[27]；葡萄果實的轉錄組測序結果證實，溫度對類黃酮代謝途徑可能存在轉錄后或翻譯后調控[28]。但是，目前關于溫度對茶樹次生代謝產物的影響還未見報道。表1和表3結果證明，秋茶葉片的溫度可能在轉錄水平上調控兒茶素合成基因CsPAL、CsF3′5′H、CsANS、CsUFGT與氨基酸合成基因CsGS、CsGOGAT、CsTS1的表達，進而影響秋茶茶多酚、氨基酸的合成積累。咖啡堿合成基因CsTCS1的表達雖與葉片溫度相關系數達0.511，但與咖啡堿含量無直接相關性。因此，在合成基因的轉錄調控方面，葉片溫度可能不是影響秋茶咖啡堿合成的關鍵因素。

光合作用是葡萄糖、果糖、蔗糖等物質的主要來源。許多研究報道糖作為碳源和能源或信號分子促進類黃酮物質的合成[29-30]，同時調控類黃酮途徑中PAL、C4H、4CL、CHS、DFR、F3H、UF3GT等基因表達[31]。表3結果顯示，秋茶光合作用的強弱與部分品質基因的表達水平有顯著的相關性，糖類是否也作為碳源或信號分子對秋茶兒茶素、氨基酸某些合成相關基因進行調控是值得深入研究的科學問題。

隨著全球極端氣候變化越來越明顯，夏、秋季持續的高溫天氣越來越普遍[32-33]，明確光、溫度等主要環境因素對茶樹光合作用、品質成分的影響及調控機制能進一步幫助生產者采取有效管理措施在生產栽培上預防極端天氣對茶樹生長的影響，有利于茶產業更好地發展。

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