SD大鼠McA-RH7777細(xì)胞系肝癌模型構(gòu)建及其特點(diǎn)

管 陽(yáng)， 劉鳳永， 樊慶勝， 付金鑫， 陳現(xiàn)現(xiàn)， 李 鑫， 袁宏軍， 王茂強(qiáng)

肝細(xì)胞肝癌（HCC）發(fā)病率在全球惡性腫瘤中位于第6位，在所有腫瘤致死原因中占第3位［1］。由于廣泛的乙型、丙型肝炎病毒人群基礎(chǔ)，亞洲國(guó)家每年新發(fā)HCC占全球60萬(wàn)患者中78%［2］。HCC治療仍為腫瘤治療重點(diǎn)和難點(diǎn)，新治療方法層出不窮［3］。臨床應(yīng)用前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在新型治療方法研究中具有重要意義，介入治療已成為重要方法，隨著介入材料精細(xì)化，在體型較小動(dòng)物體內(nèi)實(shí)施介入操作成為可能。HCC動(dòng)物模型中同種移植性大鼠模型因可重復(fù)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、造模周期短、經(jīng)濟(jì)成本低，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有較大優(yōu)勢(shì)［4-8］。除裸鼠外，由于正常大鼠自身免疫功能健全，同種異體移植HCC模型有一定成瘤率，目前國(guó)內(nèi)較常見(jiàn)大鼠模型為Walker-256模型，也有CBRH-7919細(xì)胞株建模報(bào)道［9］。大鼠McA-RH7777細(xì)胞系HCC模型研究在國(guó)內(nèi)少有報(bào)道。本研究采用McA-RH7777細(xì)胞構(gòu)建大鼠HCC模型，現(xiàn)將相關(guān)操作細(xì)節(jié)、模型瘤體生長(zhǎng)特點(diǎn)、檢測(cè)指標(biāo)、影像學(xué)特點(diǎn)以及建模可行性和穩(wěn)定性，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

McA-RH7777細(xì)胞系由美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）典藏（CRL-1601），上海榕柏生物技術(shù)公司提供。McA-RH7777細(xì)胞培養(yǎng)方法：高糖DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Corning公司）中加入10%胎牛血清（美國(guó)Corning公司）成為完全培養(yǎng)基，加入1%雙抗（美國(guó) Corning公司），并置于 150 mm2培養(yǎng)皿（美國(guó)Corning公司），在 37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（解放軍總醫(yī)院腫瘤中心實(shí)驗(yàn)室）中培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司），體重（315±17）g，飼養(yǎng)條件為解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 建模方法

1%戊巴比妥（3 mL/kg）腹腔注射SD大鼠，剃除腹部毛發(fā)，聚維酮碘消毒手術(shù)區(qū)域后鋪無(wú)菌單，劍突處下方行腹正中切口，暴露肝臟，選擇肝右葉一處注射點(diǎn)；將處于對(duì)數(shù)增殖期McA-RH7777細(xì)胞（圖1）重懸于磷酸緩沖液（PBS）中，注射前經(jīng)錐蟲(chóng)藍(lán)染色確認(rèn)McA-RH7777細(xì)胞活性，將4×106種植細(xì)胞溶于0.2 mL PBS，以1 mL注射器緩慢推注入肝臟，完成后靜置5 min；拔針后以醫(yī)用棉簽壓迫注射點(diǎn)，確認(rèn)無(wú)滲血滲液后逐層關(guān)腹縫合，送回飼養(yǎng)籠中觀察。術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素鈉80萬(wàn)U/d，連續(xù)3 d。術(shù)前1 d至術(shù)后3 d肌內(nèi)注射地塞米松磷酸鈉（10 mg·kg-1·d-1）。

圖1 對(duì)數(shù)增殖期McA-RH7777細(xì)胞鏡下觀

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

40只SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（A組，n＝30，按照上述建模法在肝臟注射種植McA-RH7777細(xì)胞0.2 mL）、空白對(duì)照組（B 組，n＝10，按照上述建模法在肝臟僅注射等量0.9%氯化鈉溶液）。

1.4 影像學(xué)檢查

A組大鼠開(kāi)腹手術(shù)后7、14、21 d分別接受MR和增強(qiáng)CT檢查。MR檢查序列包括T1加權(quán)成像、T2加權(quán)成像、彌散加權(quán)成像（DWI）。增強(qiáng)CT檢查應(yīng)用碘普羅胺，0.9%氯化鈉溶液稀釋1倍后經(jīng)尾靜脈注射1 mL，動(dòng)脈期于對(duì)比劑注射后4 s開(kāi)始掃描。根據(jù)成瘤情況，每次檢查以T2加權(quán)像檢測(cè)成瘤大鼠瘤體長(zhǎng)徑。

1.5 血液指標(biāo)、病理及免疫組化檢測(cè)

開(kāi)腹手術(shù)后 7、14、21 d，A、B 組分別隨機(jī)取 10、3只大鼠麻醉，經(jīng)頸靜脈取血，檢測(cè)堿性磷酸酶（ALP）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（Crea）、尿素（Urea）。 放血法處死大鼠，根據(jù)成瘤情況取出腫瘤組織，作蘇木精-伊紅（HE）染色、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）免疫組化染色并測(cè)定積分光密度（IOD）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。計(jì)量資料比較用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 成瘤情況和影像學(xué)檢查

A、B組大鼠開(kāi)腹行肝臟McA-RH7777細(xì)胞注射種植和單純0.9%氯化鈉溶液注射操作均獲成功，術(shù)后無(wú)大鼠死亡及其它意外事件。根據(jù)大鼠處死后解剖探查肝臟情況，A組27只（90%）成功成瘤。

A組成瘤大鼠CT平掃檢查可見(jiàn)肝臟內(nèi)低密度病灶，CT增強(qiáng)檢查可見(jiàn)病灶動(dòng)脈期環(huán)形強(qiáng)化；MR檢查可見(jiàn)病灶T1加權(quán)為低信號(hào)，T2加權(quán)為高信號(hào)，DWI為高信號(hào)（圖 2）。7、14、21 d 時(shí)瘤體長(zhǎng)徑分別為（9.4±2.6） mm、（20.6±4.3） mm、（17.4±1.2） mm，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）（圖 3）。

圖2 A組成瘤大鼠影像學(xué)表現(xiàn)

圖3 A組成瘤大鼠瘤體長(zhǎng)徑

2.2 血液指標(biāo)檢測(cè)

A、B 組大鼠術(shù)后 7、14、21 d 血液 ALP、ALT、AST、Crea、Urea檢測(cè)結(jié)果比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表 1）。

2.3 病理及免疫組化檢測(cè)

A組成瘤大鼠術(shù)后7、14 d HE染色鏡下可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞呈大的多邊形、類(lèi)圓形，胞核大、核仁明顯、核分裂像易見(jiàn)，有明顯的細(xì)胞異型性，腫瘤細(xì)胞排列成寬條索狀，其間薄層纖維組織分割，組織中有少量壞死和血管，無(wú)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)；術(shù)后21 d腫瘤組織中度壞死，可見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)及中量纖維組織。VEGF免疫組化檢測(cè)顯示，A組術(shù)后7、14、21 d IOD 值分別為（27 233.32±5 107.20）、（37 549.71±3 248.06）、（8 113.43±1 156.70），差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.003）（圖 4）。

表1 兩組大鼠術(shù)后血液指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較 x±s

圖4 A組病理及免疫組化檢測(cè)鏡下所見(jiàn)

3 討論

目前國(guó)內(nèi)較常用的大鼠肝癌模型為Walker-256模型，Walker-256瘤株原位移植后能較好地模擬人肝癌膨脹性和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)方式。但該瘤株來(lái)源于大鼠自發(fā)性乳腺癌，具有部分肉瘤性質(zhì)，不是真正來(lái)源于HCC。McA-RH7777細(xì)胞為Buffalo大鼠HCC來(lái)源。有國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道過(guò)采用McA-RH7777細(xì)胞在Buffalo大鼠成瘤建模［10］，也有國(guó)外學(xué)者報(bào)道過(guò)注射環(huán)孢素A后采用McA-RH7777細(xì)胞在SD大鼠成瘤建模［11］。相比之下，國(guó)內(nèi)SD大鼠較Buffalo大鼠購(gòu)買(mǎi)渠道更方便且經(jīng)濟(jì)，地塞米松較環(huán)孢素A成本更經(jīng)濟(jì)，在注射地塞米松基礎(chǔ)上選用SD大鼠接種McA-RH7777大鼠HCC造模，成本低廉、成瘤率高、更符合HCC生物學(xué)特點(diǎn)，具有一定優(yōu)勢(shì)。

從影像學(xué)檢查結(jié)果看，該模型瘤體生長(zhǎng)情況可通過(guò)CT和MR監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)，其影像學(xué)特點(diǎn)為CT平掃可見(jiàn)肝臟內(nèi)低密度病灶，CT增強(qiáng)可見(jiàn)動(dòng)脈期病灶環(huán)形強(qiáng)化，MR檢查可見(jiàn)病灶T1加權(quán)為低信號(hào)，T2加權(quán)為高信號(hào)，DWI為高信號(hào)，均符合典型腫瘤影像學(xué)特點(diǎn)。然而可能由于移植性腫瘤的緣故，增強(qiáng)CT結(jié)果為環(huán)形強(qiáng)化，這與兔VX2肝癌模型上所見(jiàn)相同［12-14］強(qiáng)化方式與臨床上典型原發(fā)性HCC強(qiáng)化特點(diǎn)有所不同，類(lèi)似肝轉(zhuǎn)移瘤強(qiáng)化方式。本實(shí)驗(yàn)觀察21 d內(nèi)瘤體長(zhǎng)徑變化，發(fā)現(xiàn)腫瘤于種瘤后14 d內(nèi)生長(zhǎng)速度較快，長(zhǎng)徑能達(dá)到2 cm左右，21 d時(shí)長(zhǎng)徑較14 d普遍有所縮小，但仍有部分大鼠持續(xù)增長(zhǎng)。術(shù)后21 d腫瘤組織HE染色和VEGF免疫組化檢測(cè)結(jié)果與瘤體長(zhǎng)徑變化相應(yīng)對(duì)；術(shù)后7、14 d HE染色可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，免疫組化可見(jiàn)VEGF染色較豐富，21 d HE染色可見(jiàn)腫瘤組織內(nèi)部壞死灶，免疫組化可見(jiàn)VEGF染色匱乏。如同大多數(shù)大鼠移植性肝癌模型，大鼠McA-RH7777細(xì)胞系HCC模型腫瘤具有自限性回縮現(xiàn)象，這與大鼠自身免疫性功能有關(guān)［15］。建模14 d內(nèi)腫瘤可生長(zhǎng)至峰值，21 d內(nèi)部分大鼠腫瘤因自身免疫自限性開(kāi)始出現(xiàn)回縮現(xiàn)象，病理檢查結(jié)果也顯示腫瘤活性于14 d后下降，生長(zhǎng)不良。因此，該動(dòng)物模型僅適用于針對(duì)HCC治療的短期研究（1～2周觀察HCC生長(zhǎng)情況），長(zhǎng)期研究則因腫瘤免疫自限性會(huì)影響研究結(jié)果評(píng)判。本實(shí)驗(yàn)兩組大鼠術(shù)后7、14、21 d血液ALP、ALT、AST、Crea、Urea 間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明21 d內(nèi)該模型大鼠肝、腎功能未發(fā)生差異性改變，因此是安全的，不會(huì)對(duì)基礎(chǔ)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)造成影響。

構(gòu)建SD大鼠McA-RH7777細(xì)胞系HCC模型過(guò)程中，需要注意如下操作細(xì)節(jié)：①盡量縮短腫瘤細(xì)胞離開(kāi)培養(yǎng)基至注入肝內(nèi)的時(shí)間，確保注射入肝臟時(shí)腫瘤細(xì)胞活性。②肝臟原位注射腫瘤細(xì)胞時(shí)確保進(jìn)針深度，不可過(guò)淺，否則易使肝包膜破裂；不可過(guò)深，否則易刺穿肝臟至肝外。注射過(guò)程中針頭確保固定，緩慢推注，完成后靜置5 min再抽針，確保腫瘤細(xì)胞沉淀在肝內(nèi)，并用棉簽壓住穿刺點(diǎn)片刻，確保無(wú)外滲和出血，以免造成動(dòng)物死亡而造模失敗。③整個(gè)建模術(shù)中確保無(wú)菌條件，術(shù)后給予抗生素肌內(nèi)注射，避免創(chuàng)口感染，確保成瘤成功率。

綜上所述，SD大鼠原位注射McA-RH7777細(xì)胞構(gòu)建HCC模型是可行、穩(wěn)定、安全的，適用于針對(duì)HCC治療的短期研究。

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