黃芪破壁飲片與傳統飲片5種有效成分在大鼠體內的藥代動力學研究＊

鄧銀愛，楊澤銳，鄧 雯，成金樂＊＊

（1.廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心 廣州 510006；2.國家中醫藥管理局中藥破壁飲片技術與應用重點研究室 中山 528437；3.廣東省破壁粉粒工程技術研究開發中心 中山 528437）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有補氣升陽，固表止汗，利水消腫，生津養血，行滯通痹，托毒排膿，斂瘡生肌等功效[1]。黃芪破壁飲片是由黃芪常規飲片通過超音速氣流粉碎技術將傳統中藥飲片粉碎至D90＜45 μm（300目以上）的粉體，再經過不添加成型劑專利技術制成的30-100目的顆粒狀飲片[2]。研究表明，黃芪主要含有黃芪皂苷、黃酮類以及黃芪多糖三大類活性成分。目前同時測定黃酮皂苷類及黃酮類成分主要有HPLC-DAD-ELSD以及LC-MS法[3,4]，關于黃芪破壁飲片的藥代動力學研究筆者未見國內（外）文獻報道。

本研究應用UPLC-MS/MS同時測定了大鼠血漿中黃芪的5種有效成分（黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素），并比較了黃芪傳統飲片水煎液與黃芪破壁飲片混懸液5種有效成分在大鼠體內藥動學特點，為黃芪破壁飲片后續的體內代謝機理提供了參考依據。

1 實驗材料

1.1 試藥與儀器

黃芪破壁飲片（廣東省中山市中智藥業集團有限公司，批號為20160825）、黃芪傳統飲片（廣東省中山市中智藥業集團有限公司，批號為20160825），經廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心詹若挺研究員鑒定為豆科植物蒙古黃芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根；黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對照品(中藥固體制劑制造技術國家工程中心，純度均≥98%；批號分別為BGTG-0302、BGTG-0445、BGTG-0111、BGTG-0455、BGTG-0444)；內標柚皮素(中藥固體制劑制造技術國家工程中心，純度≥98%；批號為BGTG-0809)。

表1 洗脫條件表

高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，型號：1290)；三重四級桿質譜儀（美國安捷倫公司，型號：6470）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ3200E型）；旋轉蒸發儀（德國IKA公司，型號：RV10 basic plus）；離心機（德國艾本德公司，型號：Eppendorf 5427R）；氮氣吹干儀（北京八方世紀科技有限公司，BF-2000）；氮氣一體機（北京中興匯利科技發展有限公司，型號：NA-5L）；渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司，型號：VX-Ⅲ）；恒溫烘箱（上海博訊醫療設備廠，型號：HPX-9052MBE）。

1.2 實驗動物

SD大鼠，SPF級，雄性，體重約350-400 g，購自中國人民解放軍軍事醫學研究院基礎醫學研究所，許可證編號：SCXK-（軍）2012-0004。實驗前禁食12 h，自由飲水。

2 實驗方法

2.1 對照品與供試品溶液制備

精密稱取黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素適量，加甲醇溶解分別制備為23.4 μg·mL-1、33.6 μg·mL-1、28.4 μg·mL-1、32.6 μg·mL-1、29.4 μg·mL-1的對照品儲備液。

精密量取對照品適量，加入甲醇稀釋配制成黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素濃度分別為 46.80 ng·mL-1、50.40 ng·mL-1、48.28 ng·mL-1、48.90 ng·mL-1、49.98 ng·mL-1的標準品溶液。

精密稱取黃芪傳統飲片42 g，置于圓底燒瓶中，加入420 mL水，浸泡30 min，煮沸，回流提取兩次，每次30 min，合并兩次濾液，減壓濃縮濾液至200 mL，稀釋成0.14 g·mL-1，即得丹參傳統飲片水煎液。

精密稱取黃芪破壁飲片14.00 g，置于研缽中，慢慢加入水，研磨均勻，使成0.14 g·mL-1，即得黃芪破壁飲片混懸液。

2.2 給藥和樣品采集

取健康大鼠18只，雄性，分為2組，每組9只，即黃芪破壁飲片混懸液組和黃芪傳統飲片水煎液組。實驗前12 h禁食，自由飲水，將配置好供試藥液按照2.5 mL·100g-1灌胃給藥，每種形態藥材灌胃9只大鼠，給藥后4 h后內禁食禁水，給藥前采集空白血樣，灌胃后于5 min、15 min、30 min、1 h、2 h，3 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h、36 h、48 h、72 h眼眶取血0.5 mL，置EDTA管中，5 000 rpm離心10 min，分離血漿，-20℃冷凍保存備用。

2.3 色譜與質譜分析條件

色譜條件：色譜柱為 Agilent XDB-C18（1.8 μm，3.0×50 mm）；流動相A為0.1%甲酸-水溶液，流動相B為0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫（洗脫條件見表1）；柱溫為30℃；進樣器溫度為20℃；流速為0.2 mL·min-1（前一分鐘不進質譜）；進樣體積為2 μL。

質譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI）；檢測方式為正離子模式；掃描方式為多反應監測模式（MRM）；毛細管電壓為3 500 V；氮氣溫度為300℃，氮氣流速為5 L·min-1；鞘氣溫度為250℃，流速為11 L·min-1；噴嘴電壓為500 V。在此條件下檢測離子的信息如表2所示。

2.4 血漿樣品的處理

室溫解凍樣品后，精密吸取100.0 μL內標溶液置于5 mL離心管中，N2吹干，再吸取100 μL供試品溶液，渦旋混合，加入400 μL蛋白沉淀劑（0.1%甲酸），渦旋混合2 min，超聲4 min，13000 rpm 離心5 min，分離上清液400 μL于N2吹干，殘渣用150 μL甲醇復溶，渦旋混合2 min，超聲4 min，13 000 rpm離心5 min，取上清液2 μL進行UPLC-MS/MS分析。

2.5 數據處理

藥動學參數由DAS 3.2.6藥動學軟件處理得到，結果采用IBMSPSS 19.0統計軟件，進行數據分析。所有數據以平均數±標準差表示，數據取對數之后兩組間比較采用獨立樣本T檢驗，三組之間比較采用單因素方差分析，方差不齊則選用非參數檢驗；P＜0.05認為具有顯著性差異。P＜0.01認為具有極顯著性差異。

表2 檢測離子信息

3 實驗結果

3.1 色譜行為及專屬性

空白血漿、含對照品血漿、含藥血漿離子流圖如圖1，結果顯示黃芪中5種有效成分與血漿中其他組分分離完全，峰形良好，黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素保留時間為6.9 min、3.2 min、4.3 min、5.2 min、6.7 min。。

3.2 線性范圍和定量限、檢測限

以對照品濃度為橫坐標（X）,峰面積比為縱坐標（Y），進行線性回歸，得到黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的回歸方程分別為Y=0.0002X+0.0002、Y=0.0024X-0.0048、Y=0.0057X-0.0141、Y=0.0012X-0.0013、Y=0.0023X-0.0005；濃度依次在 0.91-468.00、0.98-504.00、0.94-482.90、0.95-489.00、0.97-499.80 ng·mL-1線性關系良好，相關系數r均大于等于0.9954；定量限依次為0.91 ng·mL-1、0.98 ng·mL-1、0.94 ng·mL-1、0.95 ng·mL-1、0.97 ng·mL-1；檢測限依次為0.30 ng·mL-1、0.33 ng·mL-1、0.31 ng·mL-1、0.32 ng·mL-1、0.32 ng·mL-1。

3.3 精密度與準確度

取質控樣品于日內和日間各測量6次，連續測定3天，計算精密度。黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素日內精密度分別為7.24%、5.02%、4.39%、5.48%、2.89%，日間精密度分別為2.83%、2.73%、3.86%、3.39%、2.12%。日內、日間RSD均小于10%（n=6），本法所建立的分析方法精密度生物樣品定量分析指導原則的要求。

3.4 基質效應及回收率

取血漿樣品測定峰面積，與流動相配制的相同濃度對照品溶液所測峰面積相比，計算血漿的回收率。黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素基質效應分別為90.60%、95.40%、92.93%、80.96%、100.54%；回收率分別為92.74%、102.02%、102.99%、106.65%、100.20%（n=6），5種成分的基質效應以及回收率均在80%-120%之間，符合生物樣品定量分析指導原則的要求。

圖1 大鼠血漿樣品總離子流圖

圖2 黃芪破壁飲片和傳統飲片中5種有效成分血藥濃度-時間曲線(Xˉ±SD,n=9)

表3 黃芪破壁飲片與傳統飲片在大鼠血漿中5種有效成分的主要藥代動力學參數(±SD,n=9)

表3 黃芪破壁飲片與傳統飲片在大鼠血漿中5種有效成分的主要藥代動力學參數(±SD,n=9)

注：1-5分別代表黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素成分；A：破壁飲片，B：傳統飲片；與B相比，*P＜0.05；**P＜0.01。

成分飲片藥動學參數1 2 3 4 5相對生物利用度2.67±1.18 1.79±0.50 1.46±0.48 2.41±0.58 A B A B A B A B A B Cmax/μg·L-1 7.91±1.54**5.379±1.48 4.28±0.56**3.00±0.24 5.43±103.02**3.49±0.33 3.32±1.33*1.95±0.81 5.43±2.11 4.63±0.98 Tmax/min 318.31±434.10**180±213.71 30.55±56.64 36.66±38.07 8.33±1.21**18.88±8.93 50.55±79.93 41.11±45.81 8.33±5 13.33±7.90 T1/2/min 480±103.92 214.56±148.26 87.31±28.6**41.81±0.29 103.42±22.14 140.16±90.93 94.08±49.86*219.22±13.29 125.83±18.10**210.86±17.37 AUC0-t/（μg·L-1*min）5 166.19±1 594.72**2 222.64±940.73 1 018.29±294.62**572.85±103.61 966.27±199.05*702.13±192.89 528.96±169.66**230.08±78.79 749.73±201.94**429.09±93.22 AUC0-∞/（μg·L-1*min）6 079.20±3 313.60**2 306.60±1 010.76 1 018.37±294.68**572.85±103.61 966.42±199.10 806.54±465.08 529.03±169.64**230.08±78.79 749.73±201.94**429.09±93.22 1.78±0.46

3.5 黃芪破壁飲片和傳統飲片5種成分在大鼠體內藥動學研究

黃芪破壁飲片混懸液和黃芪傳統飲片水煎液灌胃給藥后，大鼠血漿中5種成分藥時曲線見圖2，藥動學參數見表3。結果顯示，兩者5種有效成分的藥時曲線趨勢相似，具有相似的代謝行為，黃芪破壁飲片混懸液中5種有效成分的生物利用度均高于黃芪傳統飲片水煎液。

4 討論

黃芪破壁飲片與傳統飲片中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的AUC0-t、AUC0-∞均具有顯著性差異，以傳統飲片為參比制劑，其相對生物利用度分別為2.67±1.18、1.79±0.50、1.46±0.48、2.41±0.58、1.78±0.46，且5種成分藥-時曲線具有相似性，均出現雙峰現象。

由實驗結果可知，對大鼠灌胃給予黃芪破壁飲片混懸液及黃芪傳統水煎液，破壁飲片黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素生物利用度分別提高了167%，79%，46%，141%，78%。結合本實驗在此研究之前對黃芪破壁飲片煎煮、沖泡與傳統飲片煎煮后5種有效成分溶出含量進行比較，發現黃芪破壁飲片煎煮5-10 min可達到傳統飲片煎煮30 min的效果，破壁飲片最優工藝沖泡15 min后5種成分（黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素）可達到傳統飲片煎煮溶出量的80%-90%[5]，黃芪破壁飲片體外溶出量等于或低于傳統飲片水煎液溶出量。黃芪破壁飲片混懸液5種有效成分的生物利用度均比傳統飲片水煎液高的原因之一是黃芪破壁飲片粉體粒徑小，已達到破壁狀態，由于經植物細胞壁粉碎，可使有效物質更好地溶出釋放，同時提高藥物在胃腸道的分散度和溶出度使藥物的藥效增強[6]；原因之二是黃芪傳統飲片水煎液中能被體內吸收利用的有效成分含量為溶于水中的總量，藥渣中殘留的有效成分無法利用。黃芪破壁飲片混懸液進入體內后，破壁粉體中的有效成分持續溶出，體內可吸收利用的有效成分含量是粉體中所包含的所有物質的總量，因此藥物吸收利用率大幅提升，從而提高了活性成分生物利用度。

本研究室在該研究前對破壁飲片混懸液與傳統飲片水煎液的藥效、急性毒性進行比較研究，其研究結果與本文結論相似，具體研究如下。決明子破壁飲片混懸液為傳統飲片1/2劑量以下，小鼠小腸推進作用與傳統飲片常規量效果相似[7]。丹參破壁飲片在低于傳統飲片的劑量下即可發揮與傳統飲片相似的藥效，且丹參破壁飲片和傳統飲片用藥安全性相似[8]。參斛復方中藥破壁飲片在給藥劑量僅為參斛復方中藥合劑的1/3條件下，改善冠心病的胸悶、胸痛、心悸等癥狀的療效更佳[9]。丹參破壁飲片混懸液與丹參傳統飲片水煎液中的丹參酮ⅡA和隱丹參酮在人體內生物不等效，破壁飲片混懸液中丹參酮ⅡA和隱丹參酮生物利用度明顯高于傳統飲片水煎液[10]。

由實驗結果可知，5種成分藥-時曲線均會出現雙峰現象，文獻報道其原因之一可能是其存在肝腸循環現象。肝腸循環是指經膽汁或部分經膽汁排入腸道的藥物，在腸道中又重新被吸收，經門靜脈又返回肝臟的現象[11]。另外一種解釋就是可能藥物在胃腸道存在多吸收位點，因此導致其出現雙峰現象[12]。至于其具體是通過哪一種機制，現有研究資料并未能給出明確解釋，后期工作可對其機制進行深入研究，以探明相關機制。

中藥破壁飲片是一種創新型中藥飲片，提高了中藥飲片的均勻性、利用率，滿足現代人的用藥需求。

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