霜霉病菌誘導(dǎo)大白菜微管蛋白基因表達(dá)研究

陳曉峰 王承國(guó) 隋好林 牟晉華

摘要：本試驗(yàn)主要研究大白菜α-微管蛋白基因受霜霉病菌誘導(dǎo)的表達(dá)特點(diǎn)以及病原菌侵染下微管動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，霜霉病菌誘導(dǎo)后，大白菜抗、感病品種中兩種α-微管蛋白基因均呈現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)特點(diǎn)，且抗病品種葉片細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)較為完整。說明微管骨架在植物對(duì)抗真菌病原菌侵染中具有一定的作用。

關(guān)鍵詞：霜霉病菌；微管；α-微管蛋白；微管骨架

中圖分類號(hào)：S634.1+Q786文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）04-0009-03

Abstract This paper mainly studied the expression characteristics of the α-tubulin protein gene induced by Peronospora parasitica and the dynamic structural changes of the microtubule under the infection of Peronospora parasitica. The results showed that α-tubulin protein genes expressed in all materials after Peronospora parasitica induction， and the microtubule cytoskeleton was more complete in the resistant variety. It indicated that the microtubule cytoskeleton had a certain function in plant against fungal pathogens.

Keywords Peronospora parasitica； Microtubule； α-tubulin； Microtubule cytoskeleton

微管是真核生物細(xì)胞的重要組成部分，在細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、信號(hào)識(shí)別、細(xì)胞極性的建立等方面起著至關(guān)重要的作用[1，2]。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中，微管蛋白可以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞以不同的形態(tài)來適應(yīng)環(huán)境和功能的需求，同時(shí)對(duì)植物纖維素和木質(zhì)素合成、構(gòu)建完整細(xì)胞骨架均具有重要作用[3]。植物微管蛋白主要由α-微管蛋白和β-微管蛋白基因家族組成[2，4-7]。通過對(duì)α-微管蛋白基因家族研究發(fā)現(xiàn)，該基因家族具有保守性，其在結(jié)構(gòu)上非常相似，但在植物誘導(dǎo)表達(dá)和組織特異性表達(dá)上不盡相同[2，4]。

近幾年，關(guān)于微管骨架在植物抗性中的作用越來越受到重視，研究人員對(duì)其在改變植物生化特性、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)（hypersensitive response，HR）等一系列抗性反應(yīng)以及微管骨架參與植物和病原菌互作中的作用進(jìn)行了研究[8-12]。研究發(fā)現(xiàn)，不同病原菌的侵染對(duì)微管骨架的結(jié)構(gòu)影響不完全相同，可見微管骨架在植物抗性反應(yīng)中的作用尚有需要明確的地方。而關(guān)于微管骨架在植物與病原菌互作中的動(dòng)態(tài)變化，其調(diào)控因子以及在信號(hào)傳導(dǎo)中的作用等，仍然是未來研究的重點(diǎn)[13-16]。

本試驗(yàn)對(duì)霜霉病菌誘導(dǎo)大白菜微管蛋白基因表達(dá)以及微管骨架受病原菌侵染在不同抗性材料中的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了研究，以期了解細(xì)胞骨架在作物抗性反應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

霜霉病菌、大白菜抗病品種“新煙雜3號(hào)”（XYZ-3）和感病品種“包頭蓮”（BTL）由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院提供。大白菜種子消毒后，在人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)至2～4片葉時(shí)用于試驗(yàn)。

免疫熒光觀測(cè)所用果膠酶和纖維素酶、微管標(biāo)記抗體均采用Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 真菌接種液的制備和接種程序

霜霉病菌（Peronospora parasitica）接種液的制備和接種參照陳曉峰等[17]的方法，最終配成1×106個(gè)/mL孢子囊懸浮接種液。處理組每個(gè)單株葉片噴涂病原菌誘導(dǎo)液，對(duì)照組用純水代替。誘導(dǎo)處理后植株需遮光、保濕處理24 h，然后揭掉遮光物，于人工氣候箱內(nèi)20～25℃、12 h/12 h光周期、相對(duì)濕度（85±5）%條件下培養(yǎng)，直至采樣結(jié)束，每處理重復(fù)3次。

1.3 熒光定量PCR檢測(cè)P. parasitica誘導(dǎo)α-微管蛋白基因表達(dá)

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 在GenBank大白菜數(shù)據(jù)庫中選取所需要的α-微管蛋白基因（Bra002261和Bra006517），引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[2]，以大白菜肌動(dòng)蛋白actin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)基因，序列見表1。

1.3.2 熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序 提取處理和對(duì)照0、12、24、36、48、72、96 h大白菜葉片RNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA合成為cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參考陳曉峰等[17]的方法，每處理重復(fù)3次。

1.4 大白菜葉片細(xì)胞微管間接免疫熒光檢測(cè)

霜霉病菌誘導(dǎo)接種36 h后采集抗、感病大白菜植株葉片，參考張靜宜等[18]的方法進(jìn)行微管免疫熒光觀測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 P. parasitica誘導(dǎo)α-微管蛋白基因表達(dá)分析

從圖1可以看出，兩個(gè)微管蛋白基因均呈現(xiàn)先上升后下降的表達(dá)特點(diǎn)，在抗病品種中，兩個(gè)基因表達(dá)量均高于感病品種，經(jīng)霜霉病菌誘導(dǎo)12 h后表達(dá)量增加，誘導(dǎo)36 h均達(dá)到峰值，后逐漸下降；感病品種中，Bra006517基因表達(dá)變化趨勢(shì)與抗病品種中類似，Bra002261稍有不同，誘導(dǎo)12 h時(shí)表達(dá)量快速升高，誘導(dǎo)48 h后表達(dá)量明顯下降，72 h后恢復(fù)到起始表達(dá)量。

2.2 間接免疫熒光觀測(cè)大白菜葉片微管結(jié)構(gòu)差異

從圖2可以看出，病原菌誘導(dǎo)36 h后，抗、感病大白菜品種葉片中微管顯微結(jié)構(gòu)觀測(cè)結(jié)果不盡相同，抗病品種XYZ-3葉片細(xì)胞中圍繞細(xì)胞核周圍微管骨架結(jié)構(gòu)較為完整，感病品種BTL細(xì)胞周圍微管骨架結(jié)構(gòu)出現(xiàn)分散現(xiàn)象。

3 討論

目前，關(guān)于微管骨架與植物抗病性關(guān)系的研究主要集中在寄主過敏性壞死反應(yīng)（HR）和過氧化氫累積方面。通過物理和化學(xué)因素誘導(dǎo)微管解聚，會(huì)降低植物過敏性壞死細(xì)胞的產(chǎn)生，導(dǎo)致植物對(duì)病原菌侵害抗性降低[2， 8-12，19]。通過對(duì)病原菌侵染植物組織進(jìn)行免疫熒光觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)微管骨架聚集于侵染點(diǎn)或接種點(diǎn)周圍[13-15]，說明微管蛋白基因表達(dá)量增加直接或者間接參與了植物的抗性反應(yīng)。

微管骨架廣泛存在于植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，α-微管蛋白同分異構(gòu)體在細(xì)胞和特定組織存在空間和時(shí)間表達(dá)上的差異[2]。本研究中的兩種α-微管蛋白已被證實(shí)受紫杉醇、赤霉素（GA3）等化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)[2]。本研究中我們對(duì)霜霉病菌侵染后抗、感病大白菜品種中α-微管蛋白基因表達(dá)量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)α-微管蛋白基因受P. parasitica誘導(dǎo)表達(dá)，抗病品種中微管蛋白基因表達(dá)量略高于感病品種，說明微管蛋白基因可能參與植物應(yīng)對(duì)真菌病原菌侵染的抗性反應(yīng)。通過對(duì)葉片細(xì)胞中微管骨架的免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)抗病品種葉片細(xì)胞中微管骨架結(jié)構(gòu)比較完整，而感病品種細(xì)胞微管骨架結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化，這些都證明細(xì)胞骨架在真菌病原菌與寄主之間的抗性反應(yīng)存在一定的聯(lián)系。

下一步需要著重研究整個(gè)微管基因家族的誘導(dǎo)表達(dá)特性，以及微管蛋白表達(dá)量高底是否與植物細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)變化有一定的關(guān)聯(lián)性，同時(shí)完善病原菌誘導(dǎo)植物細(xì)胞微管骨架的動(dòng)態(tài)研究。

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