數字PCR技術的發展及其在食品源性成分鑒定中的應用

王一村 李娜 翟中華 高靜靜 周莉莉 許士明

摘要：隨著全球食品工業的蓬勃發展，食品摻假及造假現象日趨嚴重，因此對相關檢測技術的開發及應用需求日益迫切。數字PCR（dPCR）是近年發展起來的一種對核酸進行精確定量的全新方法，不僅能對食品源性成分進行精準定性，更重要的是可對不同來源的摻假成分進行定量分析，因此，相對于目前源性成分鑒定中廣泛應用的實時熒光PCR（qPCR），它的應用前景更為廣闊。本文闡述了dPCR的發展歷程、特點和原理，并對dPCR發展中遇到的問題進行探討。在此基礎上就dPCR技術在食品源性成分鑒定中的原理和應用進行了綜述，并就該技術在此領域的應用前景進行了展望。

關鍵詞：數字PCR（dPCR）；食品；源性成分；鑒定；應用

中圖分類號：S126文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）04-0160-06

Abstract With the rapid development of food industry in global， the phenomenon of food adulteration and counterfeiting is being more and more serious. Thus， the development and application requirements for related detection technology are urgent. Digital PCR （dPCR） is a new developed precise quantitative method for nucleic counting in recent year. It can not only accurately determine the ingredients of food sources， but also can be used for quantitative analysis of adulterated ingredients from different sources. Therefore， compared with the real-time fluorescence PCR （qPCR）， which is widely used in the source components identification at present， it has a wider application prospect. In this paper，we elaborated the development， characteristics and principles of dPCR， and probed the problems encountered during the developing process. On these bases， the principle and application of dPCR technology in the source component identification were reviewed， and its application prospect in this field was also analysed.

Keywords Digital PCR （dPCR）； Food； Derived ingredient； Identification； Application

近幾年，數字PCR（dPCR）從產生到應用，得到了快速的發展。該技術可簡單概括為“微化分析”：一個樣品被稀釋和分割至最多包含一個目標序列拷貝的百萬甚至數百萬獨立反應室中，通過計算“陽性”反應（能夠檢測到的序列）與 “陰性”反應的數量，從而確定樣本中DNA分子的絕對拷貝數。因此，dPCR具有廣泛的應用范圍，應用于醫學、生物學等多個分支，如醫學臨床診斷方面的癌癥因子檢測[1-4]、病毒檢測[5-7]、抗藥性分析[8]、致病基因拷貝數檢測[9-12]以及突變檢測[13-16]等，生物學研究方面的基因表達分析[17-20]、基因型鑒定[21-23]、測序分析[24-26]、轉基因成分分析[27， 28]以及微生物檢測[29，30]等。

數字PCR的概念在1992年首次被提出[31]，幾年后，約翰霍普金斯大學的Bert Vogelstein和Ken Kinzler將之命名為“數字PCR”，并表明它可以用來量化大腸癌患者糞便中與疾病相關的基因突變。理論雖然簡單，實現卻困難重重。最初，實驗在市售的每個分區為5 μL的帶有384孔的孔板上進行。由于實驗需要大量的試劑，當時許多科學家對該項技術的推廣應用持有懷疑態度[32]。

如今，納米加工和微流體技術取得了很大進步，使生產成千上萬納升甚至皮升級別的分區系統成為可能。目前主流商業化產品主要應用兩種不同方法進行分區， Fluidigm 和Life Technologies 擅長利用芯片在板內創建反應室，而Bio-Rad 和 RainDance則是將試劑隔離成獨立的微滴。這使dPCR技術的應用變成了現實。

在高額利潤和快速金錢回報的驅使下，食品摻假問題已成為一種持續性的社會問題，大量的假冒偽劣食品充斥市場。傳統的源性成分檢測方法主要依靠普通PCR或熒光定量PCR（qPCR），這些方法現階段應用雖較為成熟，但仍有缺陷：一是傳統方法步驟較為復雜[33-36]；二是仍有很多不可消除的因素嚴重制約著傳統方法在食品源性成分檢測上的準確性，如PCR擴增的效率、非特異目的基因的背景干擾以及內參照基因的選取等等[37，38]；三是傳統方法無法進行精確定量。dPCR技術在食品檢測領域的應用正好可彌補以上缺陷。商業化dPCR技術的出現和應用使其在食品安全檢測領域發揮的作用越來越大。本文對該技術的發展歷史和原理進行了詳細闡述，在此基礎上介紹了該技術在食品源性成分檢測領域的進展，旨在為該技術在食品領域的應用提供參考和新思路。

1 數字PCR的特點

數字PCR是核酸絕對定量的新方法，它首先通過分液，將含有目的基因模板的PCR反應體系分配到各自獨立的反應器中，然后進行計數。因此，它具有其他方法尤其是目前應用最廣的qPCR不能比擬的優點。

（1）靈敏性更高。數字PCR通過微滴反應器將反應體系分為20 000個甚至更多的每個包含0、1甚至多個DNA拷貝的微滴。經過PCR擴增后，陽性和陰性微滴能被精確記錄。最終通過泊松分布法直接計算出目的基因的DNA絕對數量。其本質是將一個傳統的PCR反應分解成數萬個反應，在這數萬個反應單元中分別獨立檢測目的序列，從而大大提高了檢測的靈敏度。

（2）耐受性更高。dPCR技術第一步反應體系分配可以使背景序列和PCR反應抑制物被均勻分配到每個反應單元，而大部分反應單元中并不含有目的序列，低豐度的目的序列被相對富集于某些反應單元中，從而顯著地降低了這些反應單元中背景序列和抑制物對反應的干擾。另外，dPCR在對每個反應單元進行結果判讀時僅判斷陽性/陰性兩種狀態，并不像qPCR依賴于Ct值，因而受擴增效率的影響大為降低，對背景序列和抑制物的耐受能力大大提高。

（3）效率更高。分區越多，dPCR的分辨率越高。對于dPCR來說，如能區分2和3個拷貝之間的差異，原則上需要200個反應室；區分10和11個拷貝之間差異，則需高達8 000個反應室。而若要達到同等精度，qPCR則需相應數量的反應次數，這無疑工作量巨大。由此可見，dPCR的效率和精度遠高于qPCR。

（4）絕對的計數定量能力。dPCR可以進行絕對定量，尤其是對于檢測低豐度基因拷貝。而且其結果直觀，不需要校準和內部控制，數據只通過絕對拷貝數的計數便可獲得。利用這種特性，dPCR也可用來進行精確定量，并校正其他分辨力和精度相對較低的方法，如qPCR[39] 。

雖然dPCR技術有其絕對的優勢，但相比傳統方法仍存在一定不足：（1）dPCR比傳統方法成本高。昂貴的儀器和相對更貴的試劑一定程度限制了dPCR技術的廣泛應用。（2）dPCR動態監測范圍沒有傳統PCR方法寬泛。例如，即使一個基因的轉錄量比另一個基因高出十億倍，qPCR技術也能夠成功監測。但dPCR檢測變化范圍寬的基因拷貝時，需要稍復雜的前期工作。（3）dPCR應用沒有其他PCR技術廣泛。如dPCR應用剛剛開始起步，而qPCR應用已相當成熟。目前許多實驗室進行的qPCR實驗遠多于dPCR。

2 dPCR類型

2.1 基于芯片的dPCR

Fluidigm在2006年生產的數字PCR儀，其原理是利用微流控芯片將兩個系統進行試劑與樣品的混合，然后對反應混合物進行分區，經PCR反應擴增后，最終讀取每個分區的結果。主要分為構造相對簡單、價格相對便宜的EP1和BioMark HD兩種系統。其特點是兩個系統都使用了復雜的微流控芯片，微型閥門將樣品劃分至大約800個反應分區（每區有12或48個樣品）。EP1系統用來監測反應結果，即只能監測反應是否成功，而BioMark HD系統不僅能實時監控反應過程，還可對假陽性結果進行排除，且該系統也可用來進行qPCR。

Life Technologies是在2009年生產的數字PCR儀，原理是通過毛細管力及樣品表面的疏水作用力在具有納米級反應孔的反應板上將樣品分液。主要產品型號為OpenArray 和 QuantStudio 12K Flex，這兩款的特點是既具有dPCR功能，也可同時進行qPCR。OpenArray機器擁有最多三片平板，每個平板包含48個陣列，每個陣列包含64個分區。QuantStudio擁有最多四片平板，也可以兼容TaqMan探針的高通量qPCR。

2.2 基于微滴的dPCR

QuantaLife公司是第一個將微滴PCR系統進行商業化的公司?，F階段最前沿的為QX200系統，設備由微滴生成儀和微滴分析儀兩部分組成。生成儀將PCR反應液生成微滴，經PCR熱循環儀擴增后，分析儀分析每個液滴的成分。微滴被吸入后，經管路分解乳化，依次通過雙色光學檢測系統進行分析，每次最多可處理96個樣品。該系統具有分辨力強和靈敏度高的明顯優勢，Floren等的研究表明，應用該系統進行定量分析，檢測限和定性檢測限分別可達到質量分數的0.01%和0.001%[40] 。此外，該系統還可進行測序或克隆分析。

Raindrop plus dPCR系統由RainDance開發。其原理和工作流程與Bio-Rad的QX200類似。該系統的原理是用RainStorm皮滴液專利技術將反應液均分為千萬個微滴。該系統也具有較強的分辨力和較高的靈敏度，檢出限可達0.0001%[41，42] 。

Bio-Rad和 RainDance公司的微滴dPCR（ddPCR）體系反應原理和特點一致，在儀器中反應室不是由物理的隔膜來分隔，而是由油、水和化學穩定劑組成的精細乳液分隔。首先，樣品通過儀器與試劑混合，并分散成微小的液滴；然后，每個樣品微滴被轉移至PCR儀中進行擴增；最后，反應管被轉移至微滴計數器中進行讀數，從而分析每一個液滴是否發生了反應。2017年1月17日，Bio-Rad宣布收購其dPCR的競爭對手——RainDance，且已在2017年第一季度完成。這進一步鞏固了Bio-Rad在dPCR領域的領先地位，我們期待著dPCR為生命科學和臨床診斷客戶提供更為多樣化的核酸檢測應用解決方案。

3 數字PCR在食品源性成分鑒定上的應用現狀

3.1 數字PCR在食品源性成分鑒定上的優勢

dPCR是一種對核酸進行精確定量的全新方法[43， 44]，它利用有限稀釋及泊松分布分析對目的DNA的拷貝數進行絕對定量[45] 。因此，對于食品源性成分鑒定來說，dPCR在定性和定量檢測方面都具有明顯的優勢。

一方面，食品種類和各類添加物繁雜，傳統方法受復雜基質影響較大，而dPCR不依賴標準曲線和對照，不受PCR抑制物及PCR效率的影響，而是通過單分子計數方式實現基因拷貝數絕對定量，結果更為準確，更適合用于食品源性成分定量分析[46] 。作為qPCR的升級版，dPCR具有更精確、更靈敏的DNA拷貝數測量結果。另一方面，dPCR的靈敏度明顯優于食品源性成分傳統鑒別方法，這在鑒別食品中摻入的微量成分時意義重大。此外，dPCR的分液技術使其擁有更高效的優點，可同時篩選多種成分，總體看來這大大節省了食品源性成分檢測領域內的成本。

3.2 dPCR在食品源性成分鑒定上的應用現狀

將dPCR技術應用于食品源性成分檢測，并對各組分進行定量分析是近幾年研究的熱點。Cai等采用dPCR方法建立了一種新的肉源性定量方法，利用該方法能夠在肉制品的質量、DNA含量及特定目標基因的拷貝數之間建立良好的線性關系，進而檢測肉類樣品中豬肉和雞肉的準確重量及百分含量，并利用上述方法對超市中買到的11種不同的肉制品中雞肉和豬肉的比例進行實測，結果表明這種新方法能精確判定豬肉和雞肉的百分含量，從而具有較大的應用前景[46] 。苗麗等為準確定量肉及肉制品中羊源性成分的含量，建立了dPCR定量檢測系統，結果顯示，在一定范圍內羊肉質量與DNA含量、DNA含量與DNA拷貝數之間存在線性關系。通過這種線性關系對各類肉含量進行定量，結果偏差小，最大僅為1.52%[47] 。利用同樣的方法，苗麗等還建立了定量檢測肉及肉制品中牛肉和豬肉含量的方法，結果也能夠準確檢出不同樣品中牛肉和豬肉的含量[48] 。

王珊等建立了一種定量檢測羊肉制品中羊源性和豬源性成分的微滴式dPCR方法，結果表明dPCR方法能夠對DNA模板進行定量分析。通過對dPCR和qPCR方法的比較，結論表明在肉種成分真偽鑒定上，dPCR方法更為科學和準確[49] 。Floren等通過將dPCR與qPCR相結合，建立了肉及肉制品中牛、馬和豬源成分的定量檢測方法，通過方法比較，證明dPCR明顯優于qPCR。而dPCR在檢測羊、馬、豬源性成分上的定量限和檢出限可低至0.01%和0.001%[40] 。Ren等利用相似的原理，用dPCR對雞、豬、山羊和綿羊肉源性進行精確定量，實驗重復性和穩定性良好[50] 。綜合來看，dPCR無論在精確性、靈敏度以及穩定性上都優于qPCR，且肉的不同部位來源并不影響實驗結果[50，51] 。

除利用dPCR進行精確定性和定量分析外，一種多重數字PCR定量檢測方法近期被用于源性成分檢測。楊碩等利用多重dPCR定量檢測技術快速檢測食品原材料及加工食品中的核桃、大豆、椰子及花生源性成分，取得巨大市場和經濟價值[52，53] 。利用相同的原理，楊華等對加工食品中摻入的雞、鴨和豬成分進行了多重dPCR的快速篩選方法研究[54] 。dPCR能一次性快速檢測多種物種，在食品檢測應用上前景廣闊。

4 問題與展望

雖然dPCR不像其他方法需要精細的校準和內控，但仍需進一步深入研究，畢竟在極其微小體積內的單分子克隆是個復雜且精細的工程?，F階段，dPCR仍處于技術應用的早期階段，如要利用dPCR得到精確的數據，以下幾個關鍵點尤其需要注意：（1）實驗的可操控性和重復性，這對dPCR尤其重要。（2）實驗的特異性。在尋找稀有目的基因時，了解假陽性率對實驗的準確性是至關重要的。在某些情況下，假陽性的數量會干擾最終的數據判斷。（3）實驗的預估性。在量化諸如拷貝數變異或基因表達等高豐度基因分子的應用上，通常需要先對目的基因濃度進行粗略估計，以便得到合適的稀釋液。否則，一個反應區內會包含多拷貝，如果每個分區都顯示出陽性反應，就無法準確計算原始分子的濃度，這必然影響實驗結果準確性。這一點還需要研究人員應用統計學知識去彌補。除以上三點之外，還要確保有足夠體積的樣品能獲取稀有目的基因片段。

dPCR技術雖在食品及食品相關產品檢測上已經發揮了巨大作用，但也存在一定局限性。一方面，儀器昂貴一定程度限制了該技術的推廣；另一方面，在定量檢測中，仍不能滿足市場中多種類、多樣式的檢測需求，比如對于市場上千奇百怪的未知摻假物質以及添加各類復雜添加劑的食品來說，其作用依然有限。還需要進一步的科研支撐來突破這類瓶頸。

總體而言，dPCR的應用潛力無疑是巨大的。隨著技術的成熟和成本的下降，相信越來越多的研究者會利用dPCR去解決現階段無法解決的科研難題，dPCR技術也將發揮越來越重要的作用。

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