響應面法優化棗果三萜酸的提取工藝研究

張瓊 張雪丹 王中堂 周廣芳 單公華

摘要：以‘魯棗1號為試材，采用響應面法優化棗果三萜酸的提取工藝條件。結果表明，棗果三萜酸提取最佳工藝為乙醇濃度70%、料液比1∶26、提取溫度65℃、超聲30 min、提取3次，棗果三萜酸含量為0.76 mg/g。

關鍵詞：響應面法；棗；三萜酸

中圖分類號：S665.109.9文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）04-0120-05

Abstract The response surface method was adopted to optimize the extraction conditions of triterpenic acids from Luzao 1 fruits. The results showed that the optimum conditions were as follows： the concentration of ethanol was 70%， the material-liquid ratio was 1∶26， the extraction temperature was 65℃，the ultrasonic extraction time was 30 min and extracting times were three. The content of triterpenic acids was 0.76 mg/g under such conditions.

Keywords Response surface method； Jujube； Triterpenic acids

棗（Ziziphus jujuba Mill.）是集食用、藥用和保健為一體的傳統滋補佳品和藥食同源果品。棗果中富含多類生物活性物質，其中有機酸含量較高，目前已從棗果中分離鑒定出33種有機酸，以三萜酸類為主，其次為齊墩果酸、樺木酸、熊果酸等[1-3]。研究表明棗果中的三萜酸能夠誘導腫瘤細胞凋亡，降低谷丙轉氨酸和谷草轉氨酶活性，起到抗腫瘤、保肝作用，同時具有較強的消炎抑菌作用[3-5]，是棗果中一類重要的生物活性物質。中國擁有世界99%的棗樹栽培面積和產量，又是世界唯一的棗出口國，因此棗三萜酸的開發與利用具有絕對的市場優勢和廣闊的發展前景。

安全高效提取是棗三萜酸得以深入開發與利用的基礎。響應面法可以用較少的試驗量有效、快速地確定多因素系統的最佳條件，該方法常用于優化食品中各種生物活性物質的綜合分離工藝條件[6，7]。因此，本試驗以自主選育的棗樹新品種‘魯棗1號為試材，采用響應面法優化棗三萜酸的提取工藝，以期為棗三萜酸的開發利用奠定理論基礎、提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試材料‘魯棗1號為山東省果樹研究所自‘金絲小棗中選育出的極早熟鮮食品種，于2011年通過國家林木品種審定委員會審定。2015年7月，于山東省果樹研究所棗資源圃摘取‘魯棗1號全紅棗果1 kg，帶回實驗室，用清水沖洗干凈，切片，用液氮研磨成粉末狀，放入-20℃冰箱中待用。

乙醇、高氯酸、香草醛、冰醋酸均為分析純，天津市凱通化學試劑有限公司產品；齊墩果酸標準品，中國科學院成都生物研究所提供。

FA135S型電子分析天平、UV-1600型紫外可見分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司產品；TH-100BQX型超聲波清洗機，濟寧天華超聲電子儀器有限公司產品。

1.2 標準曲線的制備

精密稱取熊果酸標準品25 mg于25 mL容量瓶中，加入無水乙醇溶解并定容，得到1 mg/mL標準母液。分別吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL標準母液置于10 mL試管中，沸水浴揮干，依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL 和高氯酸0.8 mL，搖勻，60℃水浴15 min，冷卻至室溫，用冰醋酸定容至刻度，混勻，置于550 nm吸光度下進行比色，測定其吸光值。以齊墩果酸含量為橫坐標、吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。通過線性擬合得到回歸方程Y=0.0885X+0.0534，R2=0.990 7。

1.3 樣品液的制備與測定

準確稱取棗粉1 g，置于50 mL三角瓶中，按一定的乙醇濃度、料液比、提取溫度、超聲30 min，提取3次，合并提取液。量取樣品液0.3 mL，置于10 mL試管中，揮干，按1.2步驟進行反應，在550 nm處測定吸光值，根據標準曲線計算棗果中三萜酸含量。

1.4 單因素試驗設計

稱取棗粉1 g，分別固定乙醇濃度為60%、料液比為1∶20、溫度為60℃、提取時間為30 min中的3個因素，分別考察第4個因素中乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、100%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、提取溫度（40、50、60、70、80℃）、提取時間（20、30、40、60、90 min）對棗果中三萜酸含量的影響，進行單因素試驗。

1.5 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，根據中心組合試驗設計原理，綜合考慮單因素試驗結果，選取對提取效果影響較大的提取溫度（X1）、料液比（X2）、乙醇濃度（X3）三個因素，采用3因素3水平的響應面分析方法（表1），分析3種因素對棗三萜酸提取工藝的影響。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 乙醇濃度對提取效果的影響 由圖1可知，棗果中的三萜酸提取量隨著乙醇濃度的增加呈現先上升后下降的趨勢，當乙醇濃度為70%時提取量達到最大值。100%乙醇提取時三萜酸含量很低，可能是乙醇濃度越高，溶出的雜質越多，與三萜酸競爭乙醇-水分子，從而導致提取率下降[8]。因此，乙醇濃度選定為70%。

2.1.2 料液比對提取效果的影響 由圖2可知，當料液比為1∶30時，三萜酸的提取量最高，再增加提取液的比例，提取量反而降低，可能是采用1∶30的料液比提取時，提取目的物在提取液中的擴散程度已達到平衡[9]，故確定料液比為1∶30。

2.1.3 提取溫度對提取效果的影響 圖3顯示，隨著溫度的升高，三萜酸的提取量逐漸增加，當溫度達到60℃時，三萜酸的提取量最大并趨于穩定。故選擇提取溫度為60℃。

2.1.4 提取時間對提取效果的影響 由圖4可知，30～60 min之間三萜酸提取量較大，提取時間對提取量影響不大，之后隨著提取時間的延長而降低。可能是由于超聲時間的延長，超聲作用強度增加，使其溶出較多的其他成分與三萜酸競爭乙醇-水而導致提取率下降[10]。因此，超聲時間確定為30 min。

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 數學模型的建立和顯著性測驗 利用Central Composite Design設計，綜合單因素影響結果，選取對提取效果影響較大的料液比、乙醇濃度和提取溫度為參數，進行3因素3水平的響應面分析試驗，試驗結果如表2。

由表3可看出，模型能解釋97.47%響應值的變化。調整決定系數為0.942 1，說明每兩個因素之間相關性良好。利用回歸分析得到三萜酸含量對以上3個因素的二次多項回歸模型為：

Y=0.77+0.061X1+0.035X2-0.027X3-0.005X1X2+0.038X1X3-0.012X2X3-0.059X21-0.098X22-78.49X23

試驗分析表明，模型整體P值很低（P<0.0001），表明該模型極顯著。失擬項（P>0.05）不顯著，可知二次方程具有很高的擬合度及可信度，試驗誤差小，因此可以用此模型對超聲輔助提取棗三萜酸的優化結果進行分析預測。

2.2.2 響應面分析 圖5至圖7直觀反映了任何2個因素交互作用對響應值的影響，乙醇濃度、料液比和提取溫度對棗果三萜酸的提取有著極顯著的影響，與表3結果相吻合。

2.3 最佳提取工藝條件的確定及驗證

用Design-Expert V8.0.6軟件得出棗果三萜酸提取的最佳工藝為：提取溫度64.74℃、料液比1∶25.85、乙醇濃度69.53%，棗果三萜酸最佳提取量為0.79 mg/g。結合實際操作中的可行性，在檢驗響應面優化棗果三萜酸提取工藝的可靠性時，將最優提取工藝條件修改為：提取溫度65℃、料液比1∶26、乙醇濃度70%。在此條件下，超聲提取棗果三萜酸的提取量為0.76 mg/g，實際值與理論值基本相符，證明試驗模型可靠。

3 結論

本試驗采用響應面法優化棗果三萜酸超聲提取工藝。利用單因素試驗分析了提取液濃度、提取溫度、料液比、提取時間對棗果三萜酸提取率的影響，料液比、提取溫度和提取濃度對棗果三萜酸提取率影響顯著，提取時間影響不顯著。

利用Design-Expert V8.0.6軟件的中心組合設計方法，選取對棗果三萜酸提取率影響顯著的提取液濃度、提取溫度和料液比3個因素，設計響應面試驗，建立數學模型，結合響應面交互作用分析結果和實際可操作性，驗證得到棗果三萜酸最佳提取工藝為：乙醇濃度70%、料液比1∶26、提取溫度65℃、超聲30 min，提取3次。

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