MTT法檢測(cè)灰直紋螟-青錢(qián)柳蟲(chóng)茶對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制作用

曾昭華，楊茂發(fā)， 2* ，楊再華

(1.貴州大學(xué) 昆蟲(chóng)研究所/貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 煙草學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽(yáng) 550011)

蟲(chóng)茶是我國(guó)特有的林業(yè)資源昆蟲(chóng)產(chǎn)品，是由特種昆蟲(chóng)取食特種植物后的排泄物制成[1-2]。因此，蟲(chóng)茶資源包括產(chǎn)蟲(chóng)茶昆蟲(chóng)和寄主植物兩部分，灰直紋螟-青錢(qián)柳蟲(chóng)茶(以下簡(jiǎn)稱“蟲(chóng)茶”)的產(chǎn)茶昆蟲(chóng)為灰直紋螟Orthopygiaglaucinalis(Linnaeus)，寄主植物為青錢(qián)柳Cyclocaryapaliurus(Batal)。灰直紋螟，別名灰雙紋螟、黃條谷螟、谷粗喙螟、黃邊褐縞螟、干果螟，屬鱗翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)螟蛾亞科(Pyralinae)直紋螟屬Orthopygia[3-4]；青錢(qián)柳Cyclocaryapaliurus(Batal) 又名青錢(qián)李(江西)、甜茶樹(shù)(貴州)、一串錢(qián)(湖北)，隸屬胡桃科Juglaruiaceae青錢(qián)柳屬Cyclocarya，是我國(guó)特有的單種屬植物，也是國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)瀕危植物之一[5]。

蟲(chóng)茶，作為茶文化中的奇葩與茶中奇珍，在湖南城步蟲(chóng)茶被稱為“茶精”，而在廣西龍勝則俗稱為“龍珠茶”[6]。蟲(chóng)茶是一種集營(yíng)養(yǎng)保健和藥用價(jià)值于一體的保健飲料。蟲(chóng)茶中含有粗蛋白、粗脂肪、糖類、單寧、維生素、咖啡因等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[7-8]，還含有人體所需的18種氨基酸[9]，其中必需氨基酸8種，這些均與優(yōu)質(zhì)茶葉并無(wú)多大差異。更可貴的是，蟲(chóng)茶還含有黃酮類、昆蟲(chóng)激素和凝血酶原以及磷、鐵、鋅、銅等多種微量元素[10-12]，這是任何優(yōu)質(zhì)茶葉無(wú)法比擬的。

乳腺癌和胃癌是人類最主要的兩大癌癥疾病，全世界每年約有120萬(wàn)女性患乳腺癌，其死亡人數(shù)高達(dá)50萬(wàn)，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，女性生活方式的顯著改變，患乳腺癌的人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)，但發(fā)病年齡逐漸降低。我國(guó)每年因胃癌死亡的人數(shù)居所有患癌死亡人數(shù)的首位(約占23.2%)[13-14]。目前，臨床主要采用手術(shù)切除、化學(xué)藥物和放射性三種方法治療癌癥，但無(wú)論哪種治療方法都有一定的局限性，無(wú)法達(dá)到理想的治療效果。因此，發(fā)掘具有抗癌作用的藥物在醫(yī)學(xué)上備受關(guān)注。據(jù)報(bào)道，蟲(chóng)茶有一定的抗癌效果，但不同蟲(chóng)茶品種及其對(duì)不同癌的效果差異較大，鑒于此，本實(shí)驗(yàn)擬采用MTT法檢測(cè)灰直紋螟-青錢(qián)柳蟲(chóng)茶分別對(duì)MCF-7和SGC-7901腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，為獲得高效、低毒、安全的抗腫瘤藥物提供科學(xué)的理論依據(jù)，同時(shí)也為蟲(chóng)茶產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用拓展更廣的應(yīng)用領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)茶的制備

將野外采集的青錢(qián)柳嫩葉自然風(fēng)干，然后放在紫外燈下殺菌，之后用于飼養(yǎng)灰直紋螟幼蟲(chóng)。收集其幼蟲(chóng)所排的代謝物，分別用14目、20目、30目、50目篩網(wǎng)進(jìn)行依次篩選分離，由于幼蟲(chóng)不同齡期所排代謝物大小不同，經(jīng)過(guò)不同規(guī)格篩網(wǎng)篩選分離后會(huì)獲得不同大小的蟲(chóng)茶成品。將收集的蟲(chóng)茶成品放入60℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干后除塵，再用紫外燈殺菌后真空密封冷凍(-20℃)保存。

1.2 蟲(chóng)茶樣品

蟲(chóng)茶：稱取200 g蟲(chóng)茶用沸水提取3次，混合3次的蟲(chóng)茶提取液裝入培養(yǎng)皿中，然后把培養(yǎng)皿放入冷凍干燥機(jī)中干燥，最后收集脫水干燥后的粉末作為蟲(chóng)茶樣品冷凍(-80℃)保存?zhèn)溆谩７Q取0.05 g蟲(chóng)茶樣品溶解于10 mL培養(yǎng)基中作為母液，然后吸取母液逐一稀釋成所需要的樣品濃度。

1.3 癌細(xì)胞株

人乳腺癌MCF-7和胃癌SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.4 主要試劑

高糖DMEM(Hyclone 公司，美國(guó))；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，中國(guó))；0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司，美國(guó))；青鏈霉素(索萊寶公司，中國(guó))；PBS緩沖液(北京鼎國(guó)昌盛生物公司)；3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)(Solarbio公司，美國(guó))；二甲基亞砜(DMSO)(Amresco公司，美國(guó))。

1.5 主要儀器設(shè)備

Marin Christ Alpha 1-2 plus 冷凍干燥機(jī)(Marin Christ公司，德國(guó))；Thermo 3111型二氧化碳培養(yǎng)箱(ThermoFisher Scientific公司，美國(guó))；Thermo全波長(zhǎng)讀數(shù)儀 Multiskan GO(ThermoFisher Scientific公司，美國(guó))；生物安全柜(Telstar Technologies公司，西班牙)；離心機(jī)(Sigma公司，德國(guó))；Motic 倒置顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，中國(guó))。

1.6 試驗(yàn)方法

1.6.1MTT法檢測(cè)蟲(chóng)茶對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7體外增殖抑制試驗(yàn) 將人乳腺癌細(xì)胞MCF-7體外培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃充分濕化條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取指數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，先用高糖DMEM完全培養(yǎng)基將細(xì)胞配置成單個(gè)細(xì)胞懸液；然后采用倍比稀釋法，調(diào)節(jié)細(xì)胞的濃度為5×104個(gè)/mL；最后將調(diào)節(jié)好濃度的細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL。將接種細(xì)胞的96孔板放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，吸出舊培養(yǎng)基，處理組每孔加入150 μL含有梯度濃度100、200、300、400和500 μg/mL的蟲(chóng)茶樣品培養(yǎng)基，每組梯度濃度設(shè)10個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)分別設(shè)有調(diào)零孔和對(duì)照組(CK)，把加好樣的96孔板置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、36 h、48 h、72 h，不同時(shí)間處理實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。每組時(shí)間處理完畢后每孔加入10 μL MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，小心棄掉上清液，然后每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10 min 后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量每孔的OD值。根據(jù)公式計(jì)算蟲(chóng)茶對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率(Cell viability inhibition)：

細(xì)胞增殖抑制率(%) = (OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組)/(OD對(duì)照組- OD空白組) ×100%

其中，空白組(blank)及為調(diào)零孔僅含有培養(yǎng)基沒(méi)有接種細(xì)胞，對(duì)照組(control)用DMEM 完全培養(yǎng)基按正常方法培養(yǎng)細(xì)胞，其余作為蟲(chóng)茶實(shí)驗(yàn)組(treated)。

1.6.2MTT檢測(cè)蟲(chóng)茶對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901體外增殖抑制試驗(yàn) 將人胃癌細(xì)胞SGC-7901體外培養(yǎng)于高糖DMEM(含10%滅活胎牛血清和1%雙抗)中。置于5%CO2、37℃充分濕化條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)處理和計(jì)算方法同1.6.1。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲(chóng)茶對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、胃癌細(xì)胞SGC-7901半數(shù)抑制濃度(IC50)

表1 蟲(chóng)茶對(duì)不同癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)Tab.1 The 50% inhibitory concentration of insect tea on different cancer cells(IC50)

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

IC50是評(píng)價(jià)一種藥物在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力方面的重要的指標(biāo)之一，由表1數(shù)據(jù)可知，蟲(chóng)茶對(duì)同一腫瘤細(xì)胞在不同時(shí)間段的誘導(dǎo)凋亡能力不同，如對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，24 h后蟲(chóng)茶的IC50為(887.43±1.68) μg/mL，72 h后蟲(chóng)茶的IC50為(136.68±1.14)μg/mL；而對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901，24 h后蟲(chóng)茶的IC50為(826.78±1.35)μg/mL，72 h后蟲(chóng)茶的IC50為(187.83±1.27)μg/mL。這表明，蟲(chóng)茶誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其作用效果越明顯。同時(shí)蟲(chóng)茶對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡能力并不相同，如對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，36 h后蟲(chóng)茶的IC50為(322.17±1.42)μg/mL，48 h后蟲(chóng)茶的IC50為(178.72±0.94)μg/mL；但對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901，36 h后蟲(chóng)茶的IC50為(364.06±0.97)μg/mL，48 h后蟲(chóng)茶的IC50為(220.35±1.21)μg/mL。由此可知處理24 h之后的各時(shí)間段，蟲(chóng)茶對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖抑制效果更好。

2.2 蟲(chóng)茶對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的影響

圖1結(jié)果表明：蟲(chóng)茶對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖抑制作用與蟲(chóng)茶濃度及處理時(shí)間呈正相關(guān)。從圖1A可知，蟲(chóng)茶處理72 h內(nèi)蟲(chóng)茶濃度和抑制率成線性關(guān)系；48 h和72 h處理內(nèi)蟲(chóng)茶濃度為500 μg/mL時(shí)抑制率幾乎相等，其分別為(94.67±3.59)%和(95.18±2.48)%；由此可知一定濃度蟲(chóng)茶的抑制率達(dá)到其藥效發(fā)揮的最大值時(shí)，其抑制率不會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，這與其他抗腫瘤藥物的特性相符。由圖1B可知：蟲(chóng)茶濃度為500 μg/mL時(shí)48 h內(nèi)其抑制率和時(shí)間成線性關(guān)系，48 h后其抑制率隨時(shí)間的增加幾乎不變，由此可知蟲(chóng)茶濃度為500 μg/mL時(shí)其最佳處理時(shí)間為48 h。

A-不同時(shí)間處理抑制率隨蟲(chóng)茶濃度變化曲線；B-不同蟲(chóng)茶濃度處理抑制率隨時(shí)間變化曲線

2.3 蟲(chóng)茶對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的影響

由圖2結(jié)果可知：蟲(chóng)茶對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的抑制率與濃度及處理時(shí)間呈正相關(guān)。從圖2A結(jié)果可知，在48 h內(nèi)蟲(chóng)茶濃度為100 μg/mL至400 μg/mL時(shí)其抑制率跟濃度成線性關(guān)系，分別為(31.82±2.32)%、(42.98±1.89)%、(54.97±2.13)%和(64.78±1.86)%，蟲(chóng)茶濃度為500 μg/mL時(shí)抑制率為(88.78±3.23)%，其增幅最大。圖2B結(jié)果表明：蟲(chóng)茶濃度為500 μg/mL時(shí)處理48 h以前其抑制率跟處理時(shí)間呈線性關(guān)系，同時(shí)處理48 h和72 h的抑制率幾乎相等，分別為(88.78±3.23)%和(90.92±2.27)% ，即蟲(chóng)茶對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901抑制的最佳濃度為500 μg/mL，最佳處理時(shí)間處理為48 h。

3 結(jié)論與討論

惡性腫瘤是目前威脅人類健康的主要疾病之一。在我國(guó)，采用傳統(tǒng)的中藥來(lái)治療惡性腫瘤的方式由來(lái)已久，相比于西藥來(lái)說(shuō)，中藥在治療惡性腫瘤方面有其非常獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如作用全面，有助于提高病人抵抗力并可延長(zhǎng)病人壽命；藥性溫和，治療過(guò)程中不會(huì)給病人帶來(lái)難以承受痛苦；毒副作用小及病愈后不易復(fù)發(fā)等優(yōu)點(diǎn)。近些年來(lái)，為尋找新型抗腫瘤藥物，國(guó)內(nèi)外學(xué)者掀起了一場(chǎng)研究和開(kāi)發(fā)利用中草藥的熱潮。蟲(chóng)茶是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，明代李時(shí)珍在《本草綱目》中記載有“茶蛀蟲(chóng)，此裝茶籠內(nèi)蛀蟲(chóng)也，取其屎用，蛀屑聹耳出汁，繳凈，摻之……”蟲(chóng)茶是最好的天然有機(jī)茶，它是動(dòng)物和植物精華的結(jié)晶。蟲(chóng)茶馥郁甘冽，醇香宜人，具有清熱解毒、祛暑降溫、生津止渴、順氣解表、健脾益胃、增進(jìn)食欲、明目益神、除乏去膩、消除疲勞、振奮精神、涼血降壓、散瘀止血之功，對(duì)于燥熱所致的鼻衄、牙齦出血，痔瘡出血，以及增強(qiáng)血管彈性、韌性，降低血壓、血脂、防治心血管疾病等癥狀，均有良好的療效[15]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，灰直紋螟-青錢(qián)柳蟲(chóng)茶對(duì)人MCF-7乳腺癌細(xì)胞和SGC-7901胃癌細(xì)胞的體外增殖具有顯著的抑制作用，其抑制效果與蟲(chóng)茶濃度的增加及處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈正相關(guān)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知灰直紋螟-青錢(qián)柳蟲(chóng)茶對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用與其它種類的蟲(chóng)茶有相同的抑制效果甚至更好，如馮霞等[16]和Qian等[17]研究表明，蟲(chóng)茶可以起到促進(jìn)TCA8113人舌鱗癌細(xì)胞凋亡的作用；Zhao等[18]研究也發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)茶對(duì)小鼠頰黏膜癌具有較好的抗癌效果；張靜和趙欣[19]研究表明蟲(chóng)茶對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長(zhǎng)具有相對(duì)最強(qiáng)的抑制效果；趙欣[20]發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)茶中粗多酚(KMICP) 能完全抑制對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)；Suo等[21]研究發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)茶能誘導(dǎo)HepG2 人肝癌細(xì)胞的凋亡。同時(shí)鄧瀟瀟和趙欣[22]、Zhou等[23]和王睿等[24]發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)茶對(duì)小鼠胃損傷、胃潰瘍以及肝損傷具有較好的預(yù)防及治療作用；Liao等[25]通過(guò)建立動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)茶水提取物可降低小鼠因Ccl4誘導(dǎo)引起的肝損傷以及在小鼠體內(nèi)有較強(qiáng)的抗氧化能力。

IC50是評(píng)價(jià)一種藥物在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力方面的重要的指標(biāo)之一。灰直紋螟-青錢(qián)柳蟲(chóng)茶對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和胃癌細(xì)胞SGC-7901的抑制效果并不完全相同，由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，蟲(chóng)茶處理48小時(shí)，對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，蟲(chóng)茶的IC50為(178.72±0.94)μg/mL；對(duì)于人胃癌細(xì)胞SGC-7901，蟲(chóng)茶的IC50為(220.35±1.21)μg/mL。蟲(chóng)茶處理72小時(shí)，對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，蟲(chóng)茶的IC50為(136.68±1.14)μg/mL；對(duì)于人胃癌細(xì)胞SGC-7901，蟲(chóng)茶的IC50為(187.83±1.27)μg/mL。這表明，不同的腫瘤細(xì)胞對(duì)于蟲(chóng)茶的敏感性具有差異，其原因很可能是由于不同的腫瘤細(xì)胞來(lái)源于不同的組織器官，它們之間具有基因表達(dá)的差異性以及不同的代謝特點(diǎn)，究其主要原因還需進(jìn)一步的研究。

本研究結(jié)果表明：通過(guò)MTT法檢測(cè)出灰直紋螟-青錢(qián)柳蟲(chóng)茶對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和胃癌細(xì)胞SGC-7901具有明顯的抑制作用，處理24 h后蟲(chóng)茶對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖抑制比對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的抑制效果更好。灰直紋螟-青錢(qián)柳蟲(chóng)茶抗腫瘤效果與其他種類的蟲(chóng)茶具有相似之處甚至更好，這表明灰直紋螟-青錢(qián)柳蟲(chóng)茶具有極大的開(kāi)發(fā)潛力。本研究的結(jié)果將為后面進(jìn)一步篩選不同種蟲(chóng)茶針對(duì)某一腫瘤細(xì)胞具有更好的抑制作用提供科學(xué)的理論依據(jù)，同時(shí)為灰直紋螟-青錢(qián)柳蟲(chóng)茶的開(kāi)發(fā)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究只從宏觀方面探究了灰直紋螟-青錢(qián)柳蟲(chóng)茶對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外增殖抑制作用，要摸清灰直紋螟-青錢(qián)柳蟲(chóng)茶誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及獲取蟲(chóng)茶的抗腫瘤活性成分還需進(jìn)一步的探究。

致謝：貴州大學(xué)昆蟲(chóng)研究所研究生楊佳琪在細(xì)胞培養(yǎng)方面給予了大力幫助，新西蘭奧克蘭大學(xué)博士生劉健鋒對(duì)論文提出了修改建議，在此一并表示衷心感謝！

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