假臭草和勝紅薊提取物抑菌活性及穩定性研究

周怡 陳雅婷 王奇志 余巖

摘 要 為了更好地利用入侵植物假臭草[Praxelis clematidea（Griseb.）R.M. King & H. Rob.]與勝紅薊（Ageratum conyzoides L.），本文篩選了2種入侵植物不同乙醇濃度提取物對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）抑菌的最適提取濃度，檢測抑菌活性高的提取物的最低抑制濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）和最低殺死濃度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC），并評價其抑菌的熱穩定性、紫外光輻射穩定性和氧化穩定性。結果表明：假臭草莖葉的70%乙醇提取物[抑菌圈直徑（34.70±0.93）mm]及勝紅薊葉的50%乙醇提取物[抑菌圈直徑（30.95±1.30）mm]抑菌活性高，MIC值分別是0.78和3.13 mg/mL，MBC值是 3.13和25.00 mg/mL，并且抑菌活性具有較好的熱穩定性和紫外光輻射穩定性，假臭草提取物的氧化穩定性優于勝紅薊提取物。對金黃色葡萄球菌抑菌活性高的2種入侵植物提取物具有一定的抑菌活性穩定性，在開發植物源抑菌劑方面有潛在應用價值。

關鍵詞 假臭草 ；勝紅薊 ；金黃色葡萄球菌 ；抑菌活性 ；抑菌穩定性

中圖分類號 S482.2+92 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.03.017

Abstract Invasive plants Praxelis clematidea （Griseb.） R.M. King & H. Rob. and Ageratum conyzoides L. were extracted with different concentrations of ethanol to observe their activities against Staphylococcus aureus in order to utilize the invasive plants. The optimum extraction concentrations of these 2 invasive plants were screened and the minimum inhibitory concentration （MIC） and the minimum bactericidal concentration （MBC） of the extracts with high antibacterial activity were detected. The thermal stability， UV stability and oxidation stability of the extracts against the bacterium S. Aureus were evaluated. The results show that the 70% ethanol extract [inhibition zone diameter （34.70±0.93）mm] of P. clematidea and 50% ethanol extract [inhibition zone diameter （30.95±1.30）mm] of A. conyzoides had the highest antibacterial activity with their MIC values being 0.78 mg/mL and 3.13 mg/mL， and the MBC value 3.13 mg/mL and 25.00 mg/mL， respectively. The antibacterial activity of the extracts had a good thermal and UV stability， and the P. clematidea extract had a higher oxidation stability than the A. conyzoides extract. The ethanol extracts of the 2 invasive plants with high antibacterial activity against S. aureus demonstrates antibacterial stability， suggesting the potential for development of plant-derived antimicrobial agents by using these 2 invasive plants in the future.

Keywords Praxelis clematidea ； Ageratum conyzoides ； Staphylococcus aureus ； antibacterial activity ； antibacterial stability

假臭草[Praxelis clematidea（Griseb.）R.M. King & H. Rob.]和勝紅薊（Ageratum conyzoides L.）是中國南方常見的惡性入侵雜草[1-2]，對農林牧業及生物多樣性都造成嚴重的影響，目前對其防治措施主要以拔除和噴施化學除草劑為主，防治成本高且對環境污染嚴重[3]。因此對假臭草資源化利用是對其防除的新策略。

盡管假臭草和勝紅薊的主要化學成分有明顯差異[4-10]，但研究發現，2種入侵植物對多種病原微生物都具有一定的抑菌活性。Wang等[11]發現，假臭草精油對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和辣椒疫霉菌（Phytopthora capsici）具有一定抑制作用；Oliveira-filho等[12]研究結果表明，假臭草乙醇提取物對白色念珠菌（Candida albicans）有顯著抑制作用；Filho等[6]從假臭草中分離得到的5，7，4′-三甲氧基黃酮對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和大腸桿菌（Escherichia coli）均具有抑菌活性；孔垂華等[13]研究表明，勝紅薊對水稻紋枯病（Thanatephorus cucumeris）和花瓜灰霉病（Botrytis cinerea）有一定抑制作用；Okunade 等[14]發現，勝紅薊對產黃青霉（Penicillium chrysogenum）和蔓枯病菌（Didymella bryoniae）均有抑制活性；Nogueira 等[15]研究發現，勝紅薊揮發油可以抑制黃曲霉毒素B1的產生；Adetutu 等[16]在對勝紅薊乙醇提取物的研究過程中發現，其對大腸桿菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌都有較好的抑制活性。更有研究表明，假臭草和勝紅薊的乙醇提取物對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌活性較為明顯[17]。綜上所述，2種入侵植物資源豐富，是潛在植物源抑菌劑的來源，并且未有關于2種植物不同乙醇濃度提取物抑菌活性穩定性的報道。因此，本研究將進一步探索2種入侵植物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性，首次篩選出乙醇提取物抑菌的最適濃度，并檢測抑菌活性高的提取物的最低抑制濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）和最低殺死濃度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC），評價其抑菌活性的穩定性（熱、紫外光輻射和氧化穩定性），為更好的利用2種入侵植物資源，實現變廢為寶提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料

將假臭草的莖葉鮮樣和勝紅薊的葉部鮮樣沖洗干凈剪段后放入45℃鼓風干燥箱，干燥3 d后，磨粉，過40目篩，放入塑封袋備用。

供試菌種：金黃色葡萄球菌（S. aureus）。

主要儀器和試劑：YB-2000A型高速多功能粉碎機，浙江康永市速鋒工貿有限公司；N-110型旋轉蒸發儀，EYELA； SW-CJ-2F型超凈工作臺，蘇州凈化；SHP-250型恒溫培養箱，上海精宏實驗設備公司；UV-1200型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；細菌濾器，廈門綠茵試劑有限公司；中國藥典標準牛津杯，廈門綠茵試劑有限公司；無水乙醇，AR，國藥集團有限公司；吐溫-80，AR，廈門泰京生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制備

稱取植物干粉40 g，按料液比1∶5（g/mL），用0、30%、50%、70%和95%不同濃度乙醇浸泡12 h后減壓抽濾，濾渣用等體積的溶劑浸泡，重復2次；合并3次所得濾液，35～45℃減壓旋蒸，得到有機提取物浸膏，浸膏用40 mL 50%乙醇和20%吐溫-80 混合溶液溶解稀釋，使其濃度為1 g/mL，對照溶劑為50%乙醇和20%吐溫-80的混合液。

1.2.2 抑菌活性的測定

采用牛津杯法[18]對不同乙醇濃度提取物的抑菌活性進行測定。向每個牛津杯中加入150 μL不同濃度乙醇提取物，對照溶劑為50%乙醇和20%吐溫-80的混合液，于37℃恒溫培養箱培養24 h后，觀察細菌生長情況，采用十字交叉法，統計抑菌圈直徑，每組實驗重復3次。篩選出抑菌活性高的提取物，以備后續實驗使用。

1.2.3 MIC和MBC測定

取抑菌活性高的提取物，采用試管二倍遞減稀釋法[19]置入10支滅菌試管中的濃度分別為：50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20和0.10 mg/mL，每只試管中加入濃度為1×108 cfu/mL的細菌菌懸液50 μL，對照組加入等量無菌水，37℃的搖床培養24 h后，每管吸出2 mL在紫外可見分光光度計上測定吸光值，若處理組和對照組的吸光度值為0，則認為培養基中完全沒有菌生長，未長菌培養基中最低的濃度作為提取物的最低抑制濃度（MIC），將上述最低抑制濃度培養物繼續在37℃恒溫培養箱中培養24～48 h，求出最低殺死濃度（MBC）。

1.2.4 穩定性評價

對抑菌活性高的提取物的熱穩定性、紫外光輻射穩定性和氧化穩定性進行測定。

1.2.4.1 熱穩定性

取等量濃度為200 mg/mL的提取物分別置于4、40、60、80和100℃水浴及121℃濕熱條件下熱處理20 min。采用1.2.2牛津杯法測定不同處理后提取物的抑菌活性。

1.2.4.2 紫外光輻射穩定性

將浸泡有提取物的濾紙片置入超凈工作臺上吹干后，使用紫外燈照射5、10、15、20和25 min后貼在涂過供試菌的平板上。倒置放在恒溫箱中，37℃培養18～24 h后測定抑菌活性。

1.2.4.3 氧化穩定性

取提取物200 mg放于2 mL離心管中，在室溫條件下暴露于空氣中5、10、24、48和72 h后，用20%吐溫80溶液稀釋至1 mL。采用1.2.2牛津杯法測定不同處理后提取物的抑菌活性。

1.2.5 數據統計分析

采用SPSS 22.0軟件進行數據的統計與分析，Origin9.0軟件作圖。抑菌圈直徑均為3次重復實驗的平均值±標準偏差。采用最小顯著差法（LSD）多重比較進行顯著性分析（p<0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同提取物的抑菌活性

如圖1所示，假臭草和勝紅薊不同濃度乙醇提取物均對金黃色葡萄球菌具有抑制活性。其中假臭草70%乙醇提取物（抑菌圈直徑34.70±0.93 mm）和勝紅薊50%乙醇提取物（抑菌圈直徑30.95±1.30 mm）抑菌活性最好。對照溶劑對金黃色葡萄球菌無抑菌活性。

2.2 MIC和MBC測定

如表1所示，假臭草莖葉70%乙醇的提取物不同濃度（50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56和0.78 mg/mL）都沒有菌落生長，因此提取物對供試菌的MIC為0.78 mg/mL，最后結果檢測出MBC為3.13 mg/mL。

如表2所示，勝紅薊葉50%乙醇提取物物對供試菌的MIC為3.13 mg/mL，最后結果檢測出MBC為25.00 mg/mL。假臭草提取物對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC均小于勝紅薊，因此假臭草提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性要高于勝紅薊。

2.3 穩定性研究

假臭草莖葉70%乙醇提取物和勝紅薊葉50%乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的穩定性研究結果如下。

2.3.1 熱處理對提取物抑菌穩定性的影響

如圖2所示，不同溫度處理后的假臭草提取物的抑菌圈直徑差異均不顯著（p>0.05），最小和最大抑菌圈直徑分別為（21.53±0.85）mm和（23.10±0.13）mm，假臭草提取物抑菌活性物質并沒有因溫度受到很大影響，說明假臭草抑菌活性物質耐高溫，具有很好的抑菌熱穩定性。勝紅薊提取物經過不同的溫度處理后，當溫度低于75 ℃時，不同溫度處理的提取物抑菌圈直徑沒有顯著差異（p>0.05）；處理溫度為100 ℃時，抑菌圈達到最大值（12.37±0.71）mm，處理溫度為4 ℃時，抑菌圈最小為（11.24±0.18）mm，二者差異顯著（p<0.05）。低溫（4℃）和常溫條件對假臭草提取物抑菌活性物質并沒有影響。在高溫條件下（100℃和121℃）勝紅薊提取物抑菌活性并沒有減弱，二者差異不顯著（p>0.05），說明勝紅薊抑菌活性物質耐高溫，具有一定的熱穩定性。

2.3.2 紫外光輻射對提取物抑菌穩定性的影響

如圖3 所示，假臭草提取物抑菌穩定性受紫外輻射的影響，隨著紫外處理時間的增加，抑菌圈直徑有逐漸減小的趨勢，抑菌活性降低，當紫外處理5 min時，抑菌活性最好，抑菌圈直徑為（24.10±0.58）mm；25 min時抑菌圈直徑最小為（21.05±0.61）mm，二者之間差異顯著（p<0.05）。勝紅薊提取物經過紫外輻射不同時間后抑菌圈差異均不顯著（p>0.05），抑菌圈直徑最大值和最小值分別為（13.43±0.81）mm和（12.34±1.24）mm。假臭草提取物抑菌穩定性受紫外輻射影響較大，勝紅薊提取物具有一定的紫外輻射穩定性。

2.3.3 氧化處理對提取物抑菌穩定性的影響

如圖4所示，假臭草提取物在經過不同的氧化時間處理后對金黃色葡萄球菌的抑菌活性總體呈減弱趨勢。當提取物經氧化處理48 h后，抑菌活性相比之前顯著降低（p<0.05），其最大和最小抑菌圈直徑分別為（18.80±0.99）mm和（16.44±0.49）mm。氧化處理對勝紅薊提取物抑菌穩定性影響較大，當氧化處理時間小于48 h時，提取物抑菌圈直徑顯著差異（p<0.05），其最大和最小抑菌圈直徑分別為（14.34±0.47）m和（10.17±0.38）mm。結果顯示，長時間氧化處理后會對假臭草提取物抑菌活性產生一定影響，而勝紅薊提取物抗氧化能力較差。

3 結論與討論

3.1 結論

研究結果顯示：假臭草和勝紅薊抑制金黃色葡萄球菌的粗提物的最佳乙醇提取濃度分別為70%和50%，并且假臭草的MIC值是0.78 mg/mL，MBC值是3.13 mg/mL；勝紅薊的MIC值是3.13 mg/mL，MBC值是25.00 mg/mL。在不同溫度條件下熱處理20 min后假臭草和勝紅薊的抑菌圈直徑變化較小，說明假臭草和勝紅薊的提取物都有較強的熱穩定性。使用紫外燈照射不同時間后顯示，假臭草抑菌圈直徑受紫外輻射影響有變小趨勢，而勝紅薊抑菌活性未有明顯變化，說明勝紅薊提取物具有較好的抗紫外輻射穩定性。當在室溫條件下暴露于空氣中不同時間后，假臭草的抑菌活性隨時間延長會出現微弱下降趨勢，勝紅薊抑菌活性下降趨勢相對于假臭草較為明顯，由此可見，假臭草提取物具有較好的抗氧化穩定性。

3.2 討論

假臭草和勝紅薊是中國南方常見的惡性入侵雜草，為了實現對其資源化利用，本研究對其提取物抑菌的最適乙醇提取濃度、抑菌活性高的提取物的MIC、MBC以及抑菌的穩定性進行了探討。另有研究表明，在同樣使用牛津杯法和二倍稀釋法測得乙醇提取物抑菌活性的條件下，五味子的MIC值為7 mg/mL，在使用濾紙片法和二倍稀釋法測得乙醇提取物抑菌活性的條件下山胡椒的MIC值為0.062 5 g/mL[20-21]，與本實驗的2種入侵植物相比其抑菌活性較弱。由此可見在抑菌活性方面相對于其他植物假臭草和勝紅薊更具優勢，并且假臭草提取物具有較好的抑菌穩定性，不受保存溫度的影響，方便儲存，也比較利于進一步對其進行分離純化，進行工業化開發利用；勝紅薊提取物具有較好的熱穩定性和紫外光輻射穩定性，而抗氧化性一般。因此，在對勝紅薊的提取物儲存時應盡量密封儲藏，避免與空氣過多接觸。2種入侵植物假臭草和勝紅薊資源豐富，可以作為優質的天然抗菌植物資源，在植物源抑菌劑方面有良好的開發前景。

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