多指標正交試驗優選菟杞強腎口服液提取工藝＊

陶松 ，劉玲 ，魏筱華 ，潘德城 ，周健 ，段舟萍

(1、南昌大學第一附屬醫院藥學部，南昌 330006；2、江西省人民醫院藥學部，南昌 330008)

菟杞強腎口服液是根據古人治療不孕不育經驗的基礎，汲取了五子衍宗丸[1]的組方特點，結合腎虧引起的不育不孕的病因病機和自身的臨床經驗所立的經驗方，是我院傳統方劑。該方由枸杞子、菟絲子、覆盆子、車前子、五味子、桑葚子，韭菜子及淫羊藿八味中藥組成，本方枸杞子、菟絲子為方中之君藥，主要活性成分為為枸杞多糖、菟絲子多糖[2，3]。 覆盆子、五味子、桑椹子、淫羊藿、韭菜子為臣藥；車前子滲利濕熱，起著“反佐”作用，可以達到補中瀉，澀中有利，瀉中寓補，并治尿后余瀝不盡，為本方之佐藥。諸藥合用共奏益腎補精，助陽止遺的功效。其中淫羊藿含有主要有效成分為多糖和黃酮類化合物，還含有生物堿類、酚苷類、微量元素和有機酸等[4]，它們是菟杞強腎口服液發揮藥效的重要物質基礎，且主要有效成分易溶于水，本試驗采用正交試驗設計，以淫羊藿苷、干膏得率、總黃酮、總多糖的含量為考察指標，采用多指標綜合評分法[5]優選菟杞強腎口服液提取工藝。

1 儀器與試藥

UV-1206紫外分光光度計；TDE5-WS多管架自動平衡離心機；島津AUW220十萬分之一電子天平；AB104－N型萬分之一天平；KDM型調溫電熱套 （山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；Agilent 1100 高效液相色譜儀 (Agilent，USA)；SK5200H 型數控超聲波清洗器；超純水機；10ml具塞試管；所用玻璃儀器均為天玻牌A級。

蘆丁對照品（批號：100080-200707，含量測定用，中國藥品生物制品檢定所）；D-無水葡萄糖對照品（批號：110833-200503，含量測定用，中國藥品生物制品檢定所）；淫羊藿苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號：110737-200312）；實驗所用藥材購自江西江中武寧中藥有限公司，經本院中藥專家鑒定均為合格品；甲醇（色譜純，山東禹王實驗有限公司化工分公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 試驗設計 根據此方的傳統服用方法，采用水為溶媒，試驗以提取時間、提取次數、加水量為考察因素，以干膏得率、淫羊藿苷、總黃酮及多糖的含量作為考察指標，正交試驗因素水平設計見表1。

表1 因素水平表

2.2 淫羊藿苷含量測定

2.2.1 色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-水（63：37）；體積流量：1.0ml/min；檢測波長：270nm；柱溫：25℃；進樣量：10μl。

2.2.2 溶液制備 對照品溶液的制備：取淫羊藿苷對照品2.24mg，精密稱定，置10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置10ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻即得對照品溶液。供試品溶液的制備：精密吸取菟杞強腎口服液2ml置于25ml量瓶中，加甲醇超聲處理30min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，經0.45μm濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.3 標準曲線繪制 精密吸取淫羊藿苷對照品溶液 1、5、10、15、20μl注入高效液相色譜儀， 記錄色譜峰面積，以對照品濃度（X）為橫坐標對峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為：y=1318.1x+13.923，相關系數r=0.9999。線性范圍在0.0224-0.448μg，呈良好的線性關系。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取淫羊藿苷對照品溶液（0.0224mg/ml），重復進樣 6 次，每次進樣 10μl，按色譜條件測定，計算，結果淫羊藿苷的峰面積平均值為314.6，RSD值為1.12%，表明儀器的精密度良好。

2.2.5 溶液穩定性試驗 按“2.2.2”項下制備供試品溶液，放置 0、2、4、8、12、24h 后，按上述色譜條件進行HPLC分析。記錄峰面積，計算，結果淫羊藿苷峰面積的RSD值為1.43%，表明供試品溶液在24h內基本穩定。

2.2.6 重復性試驗 取同一批號樣品各6份，按“2.2.2”項下方法制備樣品溶液，按上述色譜條件進行HPLC分析，以淫羊藿苷峰面積平均值計算含量，結果平均含量為0.2083mg/ml，含量的RSD值為1.39%，表明該方法重復性較好。

2.2.7 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的本品溶液（批號：20170721）2ml，各 6 份，分別精密吸取淫羊藿苷對照品溶液 2ml（0.224mg/ml），搖勻，按樣品的處理方法將其制成供試品溶液，按上述液相色譜條件測定，計算加樣回收率，結果淫羊藿苷的平均回收率為100.08%，RSD為1.25%，該法回收率較高。

2.3 菟杞強腎口服液中總黃酮含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對照品22.00mg，置于100ml容量瓶中，加60%乙醇適量超聲溶解，再加60%乙醇至刻度，搖勻，即得每1ml含無水蘆丁0.22mg的對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密吸取本品溶液1.0ml于10ml容量瓶中，加無水乙醇至刻度，邊加邊搖，待沉淀完全后，移至10ml離心管中，離心10min，取上清液即得供試品溶液。

2.3.3 測定波長的選擇 用蘆丁對照品溶液測定菟杞強腎口服液中總黃酮的含量。精密吸取對照品溶液、樣品溶液各4.0ml，分別置于25ml量瓶中，按2.3.4標準曲線的制備項下方法操作，并在400-600nm范圍內掃描，結果在510nm處有最大吸收波長，其它成分對測定法無干擾，因此本試驗以510nm作為測定波長。

2.3.4 標準曲線的制備 使用10ml刻度吸管，精密吸取蘆丁對照品溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0ml，分別置于25ml量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉1.0ml，混勻，放置6min，然后加入10%硝酸鋁1.0ml，混勻，再放置6min；加入1mol/L氫氧化鈉溶液10.0ml，用60%乙醇稀釋至刻度，混勻，放置15min，以相應的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法于510nm處測定吸光度，以蘆丁對照品溶液濃度（mg/ml）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，蘆丁對照品濃度在0.0088-0.0616mg/ml范圍內與吸光度呈良好線性關系，其回歸方程為：y=12.817x-0.0211，r=0.9999。

2.3.5 方法學考察

2.3.5.1 精密度與重現性考察 取同一批樣品溶液，精密吸取2.5ml各6份置于25ml容量瓶中，按2.3.2方法制備供試品溶液，得6份25ml樣品溶液，每份各取4ml 3份，按2.3.4方法測定吸光度，代入回歸方程計算總黃酮含量，結果平均RSD為1.34%，說明該方法的精密度和重復性良好。

2.3.5.2 顯色穩定性考察 精密吸取樣品溶液4ml于25ml容量瓶中，按2.3.4的方法測定吸光度。當顯色體系反應完全后，每隔5min記錄一次吸光度值，連續25min考察顯色穩定性。結果在25min內樣品溶液吸光度變化不大，RSD為0.57%，故本實驗選擇在顯色體系反應完全后25min內測定吸光度值。

2.3.5.3 加樣回收率考察 精密移取已知總黃酮含量（2.5442mg/ml）成品溶液 5ml各6份，按樣品含量與加入對照品含量（1：1）的比例加入蘆丁對照品，按2.3.2項下方法制備供試品溶液并測定吸光度，計算加樣回收率，結果平均回收率99.34%，RSD為1.65%，該方法回收率較高。

2.4 菟杞強腎口服液中總多糖含量測定

2.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標品8.35mg置于100ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1ml含葡萄糖標品0.0835mg的標準工作溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密吸取樣品溶液1ml，加無水乙醇 4ml，離心（4000r/min）10min，棄去上清液，沉淀用80%乙醇溶液洗滌2-3次，每次8ml，離心10min，棄去洗液，殘渣用沸水提取5次，每次5ml，合并提取液至50ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻即得。

2.4.3 測定波長的選擇 精密吸取0.8ml葡萄糖對照品溶液（0.0835mg/ml）于10ml具塞試管中，分別加水補至2.0ml，再分別加入6%苯酚1.0ml，搖勻，再迅速沿壁滴加濃硫酸5.0ml，搖勻，沸水浴中加熱15min ml，取出，迅速冷卻至室溫（冰水浴中）。以試劑為空白，進行比色測定，在400-800nm范圍內掃描，結果在490nm處有最大吸收，因此本試驗以490nm作為測定波長。

2.4.4 標準曲線的繪制 精密吸取標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5ml， 置于 10ml具塞試管中，分別加水補至2.0ml，再分別加入6%苯酚1.0ml，搖勻，再迅速沿壁滴加濃硫酸5.0ml，搖勻，沸水浴中加熱15min，取出，迅速冷卻至室溫（冰水浴中）。以試劑為空白，于490nm波長處測吸光度A，以葡萄糖溶液濃度（mg/ml）為橫坐標，吸收度A為縱坐標，繪制標準曲線，求得標準曲線的回歸方程為A=55.041X+0.0251，相關系數 r=0.9999；結果表明，葡萄糖在0.0021mg/ml-0.0157mg/ml范圍內與吸收度具有良好的線性關系。

2.4.5 精密度試驗 按 “2.4.2供試品溶液的制備”項下制備菟杞強腎口服液樣品溶液一份，參照標準曲線繪制項下的方法進行測定，連續測定6次，記錄其吸光度值，結果RSD為0.33%（n=6），說明儀器精密度良好。

2.4.6 顯色穩定性試驗 精密吸取供試品溶液0.2ml，置于10ml具塞試管中，分別加水補至2.0ml，再分別加入6%苯酚1.0ml，搖勻，再迅速沿壁滴加濃硫酸5.0ml，搖勻，沸水浴中加熱15min，取出，迅速冷卻至室溫（冰水浴中）。另以2.0ml蒸餾水作為空白對照同上平行操作，每隔5min于490nm波長處測定吸光度值，連續測定30min考察顯色穩定性，結果平均吸光度為0.273，RSD為1.13%，說明樣品在顯色后30min內吸光度基本不變，顯色穩定性良好。

2.4.7 重復性試驗 按 “2.4.2供試品溶液的制備”項下制備菟杞強腎口服液樣品溶液6份，參照標準曲線繪制項下的方法進行測定，記錄其吸光度值，結果菟杞強腎口服液樣品中總多糖平均含量為9.0139，RSD=1.98%（n=6）， 說明該方法重復性良好。

2.4.8 加樣回收率考察 精密移取已知總多糖含量（9.0139mg/ml）成品溶液 1ml各6份，按樣品含量與加入對照品含量（1：1）的比例加入葡萄糖對照品，按“2.4.2供試品溶液的制備”項下方法制備供試品溶液，按標準曲線的測定條件測定吸光度，計算加樣回收率，結果菟杞強腎口服液平均回收率為 100.25%，RSD=1.47（n=6），該方法回收率較高。

2.5 干膏得率的測定 照 《中華人民共和國藥典》（2015年版一部）附錄XA浸出物測定法，精密量取提取定容液25ml，置已干燥至恒重的蒸發皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3h，移置干燥器中，冷卻30min，迅速精密稱定重量，以干燥品計算供試品中浸出物的含量。按下列公式計算干膏得率。

2.6 正交試驗結果與分析 按1/10處方量稱取36g藥材，共9份，結合生產實際，考察加水量、提取時間、提取次數進行提取。分別按L9(34)正交試驗表安排實驗，煎煮藥液定容至100ml，取樣測定干膏得率、淫羊藿苷、總黃酮及總多糖的含量。本試驗采用綜合評分法對菟杞強腎口服液提取工藝進行評價，結果見表2，方差分析見表3。

通過SPSS軟件，測定結果進行直觀分析和方差分析，結果表明直觀因素中，綜合值：C>B>A。因此影響提取工藝的因素順序為C（提取次數）>B（提取時間）>A（加水量）。方差分析中，C因素對有效成分含量及干膏得率有顯著性影響。所以僅提取次數對試驗結果有顯著性影響，加水量和提取時間對試驗結果均沒有顯著性影響，根據直觀分析確定最佳提取工藝為A2B3C3，但因加水量和煎煮時間均無顯著性影響，從實際生產節約成本考慮可初步確定提取工藝為：加水量10倍，煎煮3次，每次2h或加水量10倍，煎煮3次，第一次2h，第二、三次各1h，以下試驗進一步考察這兩種提取條件的差異，以最終確定最佳提取工藝。

2.7 驗證試驗 工藝1：稱取1/10處方量藥材共36g，共3份，加10倍水煎煮3次，每次2h，合并煎煮液，過濾，減壓濃縮，定容至一定體積，備用。工藝2：稱取 1/10處方量藥材共 36g，共 3份，加 10倍水煎煮3次，第一次2h，第二、三次各1h，合并煎煮液，過濾，減壓濃縮，定容至一定體積，備用。取以上6個樣品分別測定其淫羊藿苷、干膏得率、總黃酮及多糖的含量。結果見表4，可以看出，工藝一和工藝二的結果無明顯差異，從生產中節約成本和縮短生產周期考慮，選擇以工藝二即加水量10倍，煎煮三次，第一次2h，第二、三次各1h作為最終提取工藝。RSD均符合要求，表明優選出的工藝條件穩定可靠。

表2 L9(34)正交實驗結果

表3 方差分析表

3 討論

菟杞強腎口服液的處方是江西省中醫院伍炳彩教授根據古人治療不孕不育經驗的基礎，汲取了五子衍宗丸的組方特點，結合腎虧引起的不育不孕的病因病機和自身的臨床經驗所立的經驗方。菟杞強腎口服液是根據伍炳彩教授的臨床驗方開發的，主要針對腎虧引起的不孕不育，適應證突出，明確，具有治愈腎虛精少、陽痿早泄、遺精、精冷、余瀝不清等功效。現已在臨床廣泛應用，療效好，受到患者的一致好評。

考慮到此方為傳統湯劑，通過文獻檢索枸杞子、菟絲子、覆盆子、車前子、五味子、桑葚子，韭菜子及淫羊藿八味中藥化學成分得知有效成分水溶性成分較多，故采取水提法。本方枸杞子、菟絲子為方中之君藥。覆盆子、五味子、桑椹子、淫羊藿、韭菜子為臣藥，故以活性成分總黃酮、總多糖、淫羊藿苷、干膏得率為考察指標，進行多指標綜合評價分析。據對預期影響大小賦予不同權重，行加權求和而轉化為單一指標進行評價。將總多糖含量和總黃酮含量的權重系數定為0.3，淫羊藿苷和干膏得率的權重系數定為0.2，保證分析選取指標全面性，通過該方法確定最佳提取工藝，證明了優選的工藝確實合理可行。

表4 驗證試驗結果

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