消異方對行凍融胚胎移植的子宮內膜異位癥患者孕激素受體及妊娠結局影響的研究

王蕓，陳軍，魏本翠，方舟，周雪源，聞姬(.山東中醫藥大學，山東 濟南 5004；.山東中醫藥大學第二附屬醫院生殖醫學科，山東 濟南 5000；.嵐山區婦幼保健計劃生育服務中心，山東 日照 76800)

隨著凍融胚胎移植技術(Frozen-thawed Embryo Transfer,FET)的不斷發展，如何提高FET的成功率一直是研究熱點。良好的子宮內膜容受性是胚胎著床成功的重要影響因素之一[1]。孕激素受體(Progesteronereceptor,PR)是內膜種植窗口期開放過程中的關鍵因子，影響子宮內膜的容受性，進而影響妊娠率[2]。本研究探討消異方對行凍融胚胎移植的子宮內膜異位癥患者孕激素受體及妊娠結局的影響，以期尋找提高子宮內膜異位癥患者凍融胚胎移植成功率的更有效的方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象與分組

本次研究對象均來自2016年10月—2017年10月于山東中醫藥大學第二附屬醫院，經腹腔鏡及病理學檢查確診并按照美國生殖醫學協會(ASRM)分期[3]評分為Ⅲ～Ⅳ期的行凍融胚胎移植的子宮內膜異位癥患者，屬腎虛血瘀型90例。隨機分為消異方組30例，安慰沖劑組30例，空白對照組30例。中醫子宮內膜異位癥腎虛血瘀型的診斷標準參照《中醫婦科學》[4]擬定：久婚不孕且月經不調，痛經，盆腔包塊，腰膝酸痛，經血紫暗夾塊，面色晦暗，頭暈耳鳴，舌質紫暗或有瘀斑瘀點，苔少或薄白，脈沉細澀。本次研究經醫院倫理委員會批準，所有入組患者均準確告知實驗目的并簽署知情同意書。

1.1.1 納入標準

①女方因子宮內膜異位癥行體外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization-Embryo Transfer,IVF-ET)患者；②西醫診斷符合子宮內膜異位癥診斷標準[3]；③中醫診斷符合腎虛血瘀證[4]；④年齡在25～35歲之間；⑤月經周期規律，自然周期監測卵泡均能正常排卵者。

1.1.2 排除標準

①合并有糖尿病、高血壓等其他內科疾病患者；②近半年服用過其它激素類藥物治療、使用過細胞毒性藥物等；③因胚胎復蘇后質量差而無法移植者；④中斷治療，醫從性較差患者。

1.2 一般情況比較

三組患者年齡、不孕年限、BMI相比均無統計學差異，P>0.05，見表1。

表1 患者一般資料比較

1.3 治療方法

消異方組和安慰沖劑組患者月經干凈后分別開始口服中藥消異方(袋裝免煎制劑，江陰制藥)和安慰沖劑治療，每日1劑。消異方組成：肉蓯蓉、醋香附、菟絲子、生薏苡仁、炮山甲、茯苓、炒王不留、三七、肉桂、皂角刺、生水蛭、威靈仙、紅藤、敗醬草及炒雞內金；安慰沖劑為外形與消異方無差異的制劑，內容物為炒焦的大米。三組患者均自然周期監測排卵，于月經周期第7～9天開始對患者進行陰道B超監測，當監測到最大卵泡直徑達1.6 cm左右時，用排卵試紙(萬華曼普生物工程有限公司產品)監測，出現尿黃體生成素(LH)峰時，給予HCG(珠海麗珠)10 000 U，監測排卵后給予黃體支持，3 d后進行凍融胚胎移植，移植14 d后檢測晨血HCG值，陽性者于移植后35 d再行陰道超聲檢查，超聲下發現孕囊者確診為臨床妊娠。

1.4 標本采集及檢測方法

在復蘇前一周期月經干凈后分別口服中藥消異方、安慰沖劑，空白對照組無特殊處理。自然周期監測卵泡，排卵后6～8 d用刮匙刮取少量宮體前后壁的內膜，用10%福爾馬林固定，常規脫水、浸蠟、包埋、切片。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶(SP)法(北京中杉公司試劑盒)，對子宮內膜PR表達進行定位和半定量分析(具體操作見試劑盒)。用相應抗體標記的PR呈棕黃色，按著色程度評分，共0～3分：0分為不著色；1分為著色淺、呈淡黃色；2分為中度著色、呈深黃色；3分為著色深、呈棕色或咖啡色。選擇染色均勻的區域，在400倍視野下隨機選取5個區域，每一區域計數100個細胞中的陽性細胞數。表達程度采用組織化學評分(H-score)法[5]。

1.5 觀察指標

觀察三組患者種植窗期子宮內膜組織中PR的表達；比較三組患者的胚胎種植率和臨床妊娠率(胚胎種植率=著床胚胎數/移植胚胎數×100%；臨床妊娠率=妊娠周期數/移植周期數×100%)。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 患者子宮內膜情況的比較

三組患者月經第3天內膜厚度、種植窗期內膜厚度、A型內膜數比均無統計學差異，見表2。

表2 患者子宮內膜情況比較

2.2 PR表達情況和妊娠結局比較

消異方組PR評分低于安慰劑組和空白對照組，差異有統計學意義，P<0.05，且胚胎種植率和臨床妊娠率均高于安慰劑組和空白對照組，差異有統計學意義，P<0.05，見表3。

表3 患者PR表達情況和妊娠結局比較

3 討論

隨著輔助生殖技術(Assisted Reproductive Technology，ART)的發展，凍融胚胎移植技術日臻完善,臨床上可達到90%以上的胚胎復蘇率[5]。它不僅能夠降低卵巢過度刺激(Ovarian Hyperstimulation Syndrome，OHSS)的風險，還可以避免孕酮升高或內膜病變等影響妊娠率，使子宮內膜與胚胎發育同步化，從而增加ART的累積妊娠率，改善妊娠結局[6-7]。

子宮內膜異位癥(Endometriosis，EMs)是育齡期女性常見的疾病之一，25%～30%的不孕人群伴有EMs[8]。ART逐漸成為EM性不孕患者首選的助孕方式之一。但有研究報道[9],EM性不孕患者在行ART助孕時往往表現出高移植率、低妊娠率，提示胚胎著床可能是影響其妊娠結局的重要因素。胚胎著床成功的關鍵主要取決于胚胎的質量和子宮內膜的容受性，因此改善子宮內膜容受性是提高臨床妊娠率的有效方法之一[10]。正常的子宮內膜都有種植窗期，在很短時間內允許胚胎種植，通常發生在排卵后6～8 d，此時子宮內膜容受性最高[11]。子宮內膜的厚度及分型、子宮內膜組織形態學標記和子宮內膜分子生物學標記等與子宮內膜的容受性密切相關，孕激素受體(PR)就是子宮內膜分子生物學標記之一。PR參與內膜蛻膜化的過程，可以與蛻膜化因子相互作用，調節核受體的轉錄，從而影響子宮內膜容受性[12]。在整個月經周期中，子宮內膜PR的表達呈周期性變化，增生期PR含量逐漸增加，至增生晚期達高峰，中晚分泌期隨著孕激素的升高，PR表達下降，使子宮內膜在種植窗期呈現最大容受性[13]。曾有學者認為分泌期孕激素的升高與PR的降調節是胚胎著床的關鍵因素[14]。已有研究證明EMs患者無論增殖期還是分泌期，其在位內膜PR的表達均高于正常人內膜[15]，提示PR的高表達可能是導致EMs患者子宮內膜容受性低的原因之一。洪宇等人也認為EMs患者黃體中期PR的高表達可能是導致其不孕的重要因素[16]。

中醫學中沒有子宮內膜異位癥的概念，可以將其歸屬于“月經不調”“痛經”等范疇。中醫學認為根據EMs的臨床癥狀及體征可以將其歸為“血瘀證”[17]。本病的發生主要為沖任損傷及胞宮藏瀉功能失調，使經血不循常道而逆行成為離經之血，聚而成瘀。瘀血內阻影響氣血運行，不通則痛，導致疼痛。中醫認為“腎藏精，主生殖”“種子必先調經，血足則子宮易于容物”，指出女子不能受孕，主要因腎氣不足、精虧血少、沖任氣血失調、血瘀等所致。與現代醫學所說的胚胎著床的關鍵取決于子宮內膜的容受性一致。消異方是本中心多年來根據臨床實踐和經驗總結出的治療EMs的療效方。現代實驗研究證明活血化瘀類中藥對于EMs的鎮痛作用明顯,同時可以調節機體免疫,減低異位病灶的黏附、侵襲,對異位組織的消除有顯著作用[18]。方中生水蛭、炒王不留、炮山甲、三七為君藥，破血逐瘀通絡，調經止痛。現代藥理學研究發現這些藥物可以抑制血小板的黏附和聚集，降低血小板表面活性，有抗凝的作用，同時可以擴張周圍血管，改善微循環，從而調整子宮局部的血液循環。腎主生殖，方中菟絲子、肉桂、肉蓯蓉為臣藥，重在補腎助陽，溫經散寒，不僅能調節患者下丘腦-垂體-卵巢軸的反應性，對改善子宮內膜容受性有重要影響。紅藤、敗醬草、威靈仙、生薏苡仁、茯苓、皂角刺為佐藥，可清熱解毒，利水消腫，縮小異位病灶，且提高機體的免疫力。香附歸肝脾經，為氣中之血藥，可疏肝解郁，調經止痛，亦為佐藥。諸藥合用共奏補腎活血祛瘀之功。

本研究中, 消異方組PR表達明顯低于安慰劑組和空白對照組，胚胎種植率和臨床妊娠率高于其它兩組，提示消異方能靶向作用于子宮內膜上的孕激素受體，降調PR的表達，改善子宮內膜容受性，從而改善妊娠結局。EMs患者在著床窗口期子宮內膜PR的高表達降低了子宮內膜對胚胎的容受性，消異方可以下調PR的表達, 從而降低EMs對子宮內膜的不良影響,提高子宮內膜容受性，改善妊娠結局。但本研究亦有不足之處，僅只納入了腎虛血瘀一個證型，尚缺乏對其它證型的研究。且子宮內膜容受性的建立過程錯綜復雜, 同時包涵各種細胞因子和基因的共同參與與調控, 本試驗僅選取了PR進行研究與討論, 未能對其它的調控因子加以研究和印證, 在下一步的研究中我們會進一步擴大研究范圍，完善實驗方案，為改善行凍融胚胎移植的EMs患者的妊娠結局提供臨床依據。

[1] 隋曉倩,于德欽,張冬梅.子宮內膜容受性各相關標志物研究進展[J].生殖與避孕,2015,35(3):185-190.

[2] 王巧鳳,楊帆.雌、孕激素受體、生長激素受體、胰島素樣生長因子1受體與子宮內膜容受性的關系[J].中華生殖與避孕雜志,2017,37(10):855-859.

[3] Catenacci M，Sastry S，Falcone T. Laparoscopic surgery for endometriosis[J].Clin Obstet Gynecol，2009，52(3)：351-361.

[4] 羅頌平,談勇.中醫婦科學[M].北京：人民衛生出版社,2012:262.

[5] Bergquest A.Estrogen and progesterone receptors in endometriotic tissue and endometrium:comparison according to localization and recurrence[J].Fertil Steril,1993,60:63.

[6] 唐慧珍,高士友,鄧朝暉,等.三種內膜準備方案在凍融胚胎移植中的結局分析[J].生殖醫學雜志,2015,24(3):236-239.

[7] Abbas A,Homa O,Shahnaz A.Can fresh embryo transfers be replaced by cryopreserved-thawed embryo transfers in assisted reproductive cycles? A randomized controlled trial[J].Assist Reprod Genet,2010，27(7):357-363.

[8] Vlahos N F, Kalampokas T, Fotiou S.Endometriosis and ovarian cancer:a review[J].Gynecol Endocrinol, 2010, 26 (3) :213-219.

[9] 何麗霞.子宮內膜異位癥合并不孕的診治[J].華夏醫學,2016,29(1):186-189.

[10] 李華,李蓉,王麗娜,等.子宮內膜容受性治療方法的新進展[J].生殖醫學雜志,2015,24(3):240-244.

[11] Diedrich K, Fauser BC, Devroey P, et al.The role of the endometrium and embryo in human implantation[J].Hum Reprod Update, 2007, 13 (4) :365-377.

[12] Kajihara T, Brosens JJ, Ishihara O.The role of FOXO1 in the decidual transformation of the endometrium and early pregnancy[J].Med Mol Morphol, 2013, 46 (2) :61-68.

[13] Lessey BA, Killam AP, Metzger DA, et al.Immunohistochemical analysis of human uterine estrogen and progesterone receptors throughout the menstrual cycle[J].J Clin Endocrinol Metab,1988,67(2):334-340.

[14] Lessey BA, Yeh I, Castelbaum AJ, et al.Endometrial progesterone receptors and markers of uterine receptivity in the window of implantation[J].Fertil Steril,1996,65(3):477-483.

[15] 王君,李斌,范穎.子宮內膜異位癥患者內膜細胞中孕激素受體與凋亡因子Bcl-2、Bax表達的研究[J].實用婦產科雜志,2010,26(1):45-48,81.

[16] 洪宇,陳冬梅,李揚志,等.整合素αvβ3和孕激素受體在子宮內膜異位癥患者黃體中期子宮內膜中的表達[J].中國婦幼保健,2012,27(13):2024-2027.

[17] 袁小琴,邊文會.子宮內膜異位癥從“瘀”論治實驗研究進展[J].實用醫學雜志,2010,26(13):2464-2465.

[18] 劉霞,肖新春.消異方治療子宮內膜異位癥的療效觀察及安全性分析[J].天津中醫藥,2016,33(11):668-671.