金線蓮醇提物在斑馬魚中降血糖效果的探究

許璟瑾，張文娟，陳志永，李秀敏，潘裕添，王兵麗，歐一新,2，薛　鈺,3*

(1.閩南師范大學菌物產業工程技術中心，福建 漳州　363000； 2.上海交通大學，生命科學技術學院，上海　200240；3.膜生物學國家重點實驗室，北京　100101)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一種由遺傳因素和環境因素互相作用引起常見的嚴重代謝性疾病。其主要病因是源于體內胰島素信號通路受損或是胰島素靶點的敏感性降低，導致糖代謝途徑異常從而引起血液中葡萄糖含量增加，臨床上以高血糖為主要的生理病征，同時伴隨著尿糖、胰島素缺乏或作用下降。糖尿病分為 I 型糖尿病和 II 型糖尿病，胰島素絕對缺失、必需依賴外源性胰島素延續生命的患者歸為 I 型糖尿病,大部分不依賴外源性胰島素延續生命者歸為 II 型糖尿病[1-4]。在生物體內維持血糖平衡有四個非常重要的基因。胰島素(preproinsulin, insulin)是調節血糖平衡的關鍵因子[5], 胰島素由胰腺中的β細胞合成, 通過結合位于脂肪細胞、肌肉細胞等細胞上的胰島素受體，調控葡萄糖轉運體從胞漿移動至細胞膜上，從而促使細胞對葡萄糖的攝取[6-8]。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(phosphoenolpyruvatecarboxykinase1,pck-1)與糖原異生、甘油異生、肥胖和糖尿病等代謝疾病密切相關[9]，在維持葡萄糖的穩態中起關鍵的作用[10]。胰腺十二指腸同源盒基因1(pancreaticandduodenalhomeobox1,pdx-1)大多表達于胰島內分泌胰島素的β細胞和分泌生長抑素的δ細胞中[11]，在調節胰腺發育和分化中起著非常重要的作用[12-13]。神經分化因子-1(neuronaldifferentiation1,neurod-1)對胰島β細胞的發育及生理功能至關重要[14]。近年來，隨著生活水平的提高和老齡化進程的加速, 糖尿病患病率呈快速上升趨勢, 糖尿病尤其II型糖尿病已經成為繼癌癥、心腦血管疾病之后的嚴重威脅人類健康的第三大疾病[15-16]。目前，還沒有一種藥物能完全治愈糖尿病，很多西藥只能控制血糖，且有副作用。相比于西藥，中草藥不僅能降血糖，還能防止慢性并發癥的發生，有些中草藥，例如肉桂含有黃烷醇多酚抗氧化物質具有刺激胰島β細胞分泌胰島素，降低胰島素抵抗等功能。因此中草藥在治療糖尿病方面具有非常好的前景。

金線蓮(Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl.)又名金線蘭，為蘭科(Orchidaceae),開唇蘭屬(Anoectochilus)多年生珍稀藥用植物。主要分布于中國福建、臺灣以及東南亞地區[17-18]。有初步研究表明金線蓮全草水煎液具有較好的降血糖作用[19]，但是降血糖的活性成分和作用機理還不明確。因此本研究就地取材，對福建金線蓮具有降血糖作用的組分進行了篩選，并且進行了初步的機理研究。

斑馬魚基因總數(約23 500個)與人類相當，神經系統、心血管系統、內臟器官、血液以及視覺系統的發育過程在分子水平上與人的一致性高達85%，便于將實驗數據與人類的資料相比較[20-23]，并且具有體型小、易飼養等優點。所以本研究利用斑馬魚篩選金線蓮降血糖活性組分，通過檢測四個與糖代謝相關基因在金線蓮醇提物處理后的表達與高糖模型作對比，來探究金線蓮降血糖的初步機理。

1　材料和方法

1.1　實驗動物

5月齡性成熟TU品系斑馬魚(Daniorerio)，雌雄各15條，斑馬魚體長3～4 cm，由清華大學孟安明課題組惠贈，根據Westerfield[24]方法在閩南師范大學菌物產業工程技術中心斑馬魚實驗室繁殖培育。

實驗前1 d，挑選已達性成熟的斑馬魚放置于交配缸內，將雌雄魚用隔板分開，第2天清晨將隔板拔掉讓其交配產卵，待胚胎受精30 min后收集受精卵于含有Holfreter水的培養皿中，28℃恒溫培養。

1.2　主要試劑及儀器

福建金線蓮(閩南師范大學菌物產業工程技術中心培植)；丙三醇(西隴化工)；多聚甲醛(Sigma)；PBS(Sigma)3300型高速離心機(Kubota)；HH-2數顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司)；AUY320日本島津電子分析天平(上海儀田精密儀器有限公司)；小型離心機(Tiangen)；Nikon SMZ18體式熒光顯微鏡(尼康)；輔理善越捷型血糖儀(Abbott Diabetes Care)。

1.3　實驗方法

1.3.1金線蓮組分的分離與提取

準確稱量1 kg新鮮的金線蓮全草，按料液比1∶4加入蒸餾水，粉碎，80℃水浴攪拌提取，離心收集上清，沉淀物重復提取兩次，把兩次提取液合并，上清用旋轉蒸發儀蒸發濃縮至一定體積，加入4倍濃縮體積的無水乙醇，放置于4℃冰箱沉淀過夜。第二日通過抽濾把醇沉物和醇提物分離，獲得的醇提物蒸發濃縮至一定體積，真空凍干機凍干，獲得組分一:金線蓮醇提物；醇沉物加蒸餾水溶解濾紙過濾后經過5×103超濾膜超濾，超濾完之后蒸發濃縮至100 mL左右真空凍干機凍干，5×103以上組分為組分二:大分子多糖；5×103以下組分為組分三:小分子多糖。

1.3.2金線蓮具有降血糖活性組分的初步篩選

1.3.2.1藥物濃度的確定

為探索金線蓮各組分對斑馬魚胚胎作用的最佳濃度，進行了以下實驗：實驗一：受精后的胚胎分為對照組和加藥組，對照組用Holfreter水培養至72 h，金線蓮醇提物組、大分子多糖組和小分子多糖組的加藥濃度梯度都設置為50、100、500、1000 μg/mL。實驗二：受精后的胚胎用Holfreter水培養至24 h，分為兩組，對照組繼續用Holfreter水培養，模型組置換成前期實驗已經摸索確定的2%的葡萄糖溶液，斑馬魚幼魚和成魚在該濃度葡萄糖溶液脅迫下能引發急性高血糖，處理24 h后即發育至48 h時，將高糖模型組分為五組，每組40枚胚胎，其中模型組繼續加2%葡萄糖溶液，另外4組在既加葡萄糖的同時分別加入濃度為50、100、500、1000 μg/mL的金線蓮提取物，每種組分都設置該濃度梯度。實驗一和實驗二每12 h記錄胚胎死亡數，挑走死亡的胚胎，更換藥物。每次實驗做一組平行試驗組，將斑馬魚胚胎置于28℃恒溫培養箱培養。待胚胎發育至72 h觀察其死亡情況和發育情況并詳細記錄。

1.3.2.2斑馬魚組織液葡萄糖濃度的測定

受精后的胚胎用Holfreter水培養至24 h后分為兩組，對照組繼續用Holfreter水培養，模型組置換成2%的葡萄糖溶液，胚胎發育至48 h時，將高糖模型組平分為四組，其中一個孔繼續加2%的葡萄糖溶液，其他三個孔既加葡萄糖的同時，再分別加入三種金線蓮提取物，小分子多糖濃度梯度為30、40、50 μg/mL，大分子多糖和醇提物濃度梯度為300、400、500 μg/mL。由于幼魚血液太少無法檢測血糖濃度，所以待胚胎發育至72 h檢測斑馬魚組織液葡萄糖濃度。

將浸泡胚胎的藥液吸干，用Holfreter水洗兩遍，吸走死胚胎、畸形胚胎以及脫落的外膜，用PBS溶液洗兩遍，吸三十枚胚胎轉入1.5 mL EP管，把EP管中液體吸干，用2 mL注射器針頭在EP管底部扎一小孔，保證胚胎不會離心出EP管，低速離心把EP管中液體甩干，用打火機灼燒EP管，把EP管底部的小孔封住，用研磨棒把斑馬魚研磨均勻，離心取上清滴在血糖試紙檢測端，采用輔理善越捷型血糖儀測試并記錄。

1.3.3合成相關基因克隆的引物序列

本研究中所有基因序列從http://zfin.org/上下載，引物通過軟件Primer 6.0設計。引物序列如表1所示。

表1　糖代謝相關基因的引物序列

1.3.4半定量PCR檢測糖代謝相關基因的表達

按照(1.3.2.2)中的方法用金線蓮醇提物處理，待胚胎發育至72 h，每組各收集50枚，提total RNA，將RNA反轉錄成 cDNA，作為半定量PCR的模板，具體操作實驗方案參照文獻[25]。擴增條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，65℃ 30 s，之后每個循環降低3℃，72℃ 30 s，共6個循環；然后再95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共26個循環；最后72℃延伸10 min；16℃保存1 h。部分條件可以微調。

1.3.5整胚原位雜交實驗試劑與方法

原位雜交中所用探針的制備方法，原位雜交所需要的試劑的配制方法和具體的操作步驟參照文獻[25]。

2　結果

2.1　金線蓮三種提取物作用斑馬魚胚胎濃度的確定

將0.75 h的野生型胚胎加入不同組分的金線蓮提取物，培養至72 h，期間觀察統計胚胎發育及死亡情況，其結果如圖1 A所示：加入小分子多糖組分在1000 μg/mL和500 μg/mL的濃度下，死亡率是100%；在100 μg/mL時胚胎死亡率明顯降低，但發育嚴重延緩。金線蓮大分子多糖組和醇提物組在1000 μg/mL濃度時，胚胎死亡率是100%，500 μg/mL濃度下胚胎致死率較低，且發育正常。將發育至24 h的胚胎加入2%葡萄糖溶液脅迫建立高糖模型，48 h維持高糖的情況下加入不同組分的金線蓮提取液培養至72 h，胚胎發育狀況及死亡情況如圖1B所示：加入小分子多糖組分在1000 μg/mL和500 μg/mL的濃度下，死亡率是100%；濃度在100 μg/mL時雖然胚胎死亡率較低但是胚胎發育嚴重延緩，濃度在50 μg/mL時胚胎發育正常高糖模型下，金線蓮大分子多糖和醇提物在1000 μg/mL濃度時，胚胎死亡率是100%，500 μg/mL濃度下比只加金線蓮大分子多糖和醇提物的死亡率略微升高(與圖1A 500 μg/mL時相比)，且胚胎發育正常。綜合以上兩部分實驗結果，本研究設置小分子多糖實驗濃度梯度設為30、40、50 μg/mL。金線蓮大分子多糖和醇提物實驗梯度設為300、400、500 μg/mL。

2.2　斑馬魚幼魚組織液葡萄糖濃度的測定

按照(1.3.2.2)中的方法用三種金線蓮提取物分別處理斑馬魚胚胎，待胚胎發育至72 h，采用(1.3.2.2)中的測血糖方法篩選出具有降糖作用的金線蓮組分。結果如表2所示：模型組即高糖組的幼魚組織液葡萄糖濃度相比于空白對照顯著升高，加入不同濃度小分子多糖的加藥組，幼魚組織液葡萄糖濃度相對于高糖組基本上沒有降低；不同濃度的大分子多糖處理后的幼魚組織液葡萄糖濃度反而有升高的趨勢；只有加入醇提物后幼魚組織液葡萄糖濃度有明顯降低，并且隨著醇提物濃度的升高，降糖效果越明顯。由此得出初步結論：金線蓮小分子多糖和大分子多糖沒有降血糖效果，醇提物具有顯著降血糖效果。

注：A：金線蓮提取物溶解在Holfreter水中引起斑馬魚胚胎的致死率；B：金線蓮提取物在高糖模型條件下引起斑馬魚胚胎的致死率。圖1　不同濃度的金線蓮提取物對斑馬魚胚胎死亡率的影響Note. A：The mortality rate of zebrafish embryos induced by Anoectochilus roxburghii extracts dissolved in Holfreter water. B：The mortality rate induced by Anoectochilus roxburghii extracts under conditions of high glucose model.Fig.1　Effect of Anoectochilus roxburghii extracts in different concentrations on the mortality rate of zebrafish embryos

組別GroupsCtr2% Glu2%Glu+低濃度2% Glu+A2%Glu+中濃度2% Glu+B2%Glu+高濃度2% Glu+C小分子多糖Small molecular polysaccha-ride1.47±0.3013.88±0.4453.95±0.4233.82±0.5233.93±0.476大分子多糖Macromolecular polysaccha-ride1.45±0.3153.87±0.4373.90±0.4154.20±0.3634.22±0.397金線蓮醇提物Alcohol extraction1.45±0.2933.87±0.437***3.23±0.520#2.78±0.387##2.08±0.075###

注：低濃度、中濃度、高濃度對于小分子多糖分別是30 μg/mL、40 μg/mL，50 μg/mL；低濃度，中濃度，高濃度對于大分子多糖和金線蓮醇提物分別是300 μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL；高糖組與對照組相比，***P< 0.001；加藥組與高糖組相比，#P< 0.05，##P< 0.01，###P< 0.001。

Note. (A)low,(B)medium,and(C) high concentrations for the small molecules polysaccharide extracts are 30 μg/mL, 40 μg/mL, and 50 μg/mL. The (A)low,(B)medium,and(C) high concentrations for the macromolecular polysaccharide extracts andAnoectochilusroxburghiialcohol extracts are 300 μg/mL, 400 μg/mL and 500 μg/mL. The high glucose group compared with the control group,***P<0.001. Medication group compared with the high glucose group,#P< 0.05，##P< 0.01，###P< 0.001.

2.3　半定量PCR檢測糖代謝相關基因的表達

按照(1.3.2.2)中的方法用金線蓮醇提物處理，待胚胎發育至72 h，每組各收集50枚，提total RNA，反轉錄后進行半定量PCR檢測insulin、pck-1、pdx-1、neurod-1基因的表達。以β-actin為內參，其結果如圖2所示：加入葡萄糖溶液進行高糖脅迫之后，insulin、pck-1、pdx-1三個基因電泳條帶的亮度與對照組相比明顯減弱，加藥組與高糖組相比，條帶亮度總體上具有升高的趨勢，并且隨著金線蓮醇提物溶液濃度的升高，亮度越亮；neurod-1基因電泳條帶的亮度變化趨勢則相反，高糖組與對照組相比，亮度明顯增強，加入金線蓮醇提物之后，隨著金線蓮醇提物濃度的升高，亮度逐漸恢復對照水平(圖2A)。通過ImageJ軟件計算各個基因mRNA的相對表達量，結果如圖2B～D所示：insulin在高糖組中的表達只有對照組的50%，金線蓮醇提物處理使得insulin的表達量逐步恢復，呈劑量依賴性，在500 μg/mL時效果達到最佳，恢復到對照組的90%(圖2B)。高糖脅迫下pck-1 mRNA水平降低至對照組的40%，金線蓮醇提物處理濃度在500 μg/mL時，pck-1基因的表達量增加至對照組的60%，恢復效果顯著(圖2C)。pdx-1基因在加了高糖溶液之后基因表達量是對照組的70%，金線蓮醇提物處理濃度在400 μg/mL時效果最佳，pdx-1基因的表達量超過了對照組(圖2D)。neurod-1基因加了高糖溶液之后基因表達量是對照組的1.6倍，隨著金線蓮醇提物濃度的升高，在500 μg/mL時基因表達量基本恢復至對照水平(圖2E)。

以上實驗結果說明高糖模型下，insulin、pck-1、pdx-1表達下調，金線蓮醇提物可以解除高糖對insulin、pck-1、pdx-1的抑制。該研究進一步通過整胚原位雜交檢測在經過相同處理后，以上幾個基因的時空表達。

2.4　整胚原位雜交檢測糖代謝相關基因的時空表達

按照(1.3.2.2)中的方法用金線蓮醇提物處理，待胚胎發育至72 h，檢測insulin、pck-1、pdx-1和neurod-1的時空表達變化。對照組胚胎insulin基因表達正常位于胚胎軀干的右側(圖3 A)，高糖組有超過80%的比例insulin基因表達出現偏移，其中約有50%的胚胎insulin表達移至軀干中間(圖3B)，超過30%胚胎insulin偏移至軀干左側(圖3C)。加入金線蓮醇提物后，insulin的左右不對稱表達異常隨著金線蓮醇提物濃度高逐漸增加而得到明顯改善，insulin基因表達在軀干中間和偏左胚胎隨著金線蓮醇提物濃度的升高逐漸減少，在金線蓮醇提物500 μg/mL時，效果達到最佳，正常胚胎上升至67%，偏移到中間的胚胎下降到29%，偏移到中間胚胎僅僅只占4%(圖3D)。進行高糖脅迫后會使insulin基因表達部位產生偏移，使胰島素基因表達下降，加入金線蓮醇提物之后，insulin基因表達部位有明顯的恢復效果，使胰島素基因表達得到恢復，與半定量PCR結果一致。

待胚胎發育至72 h檢測pck-1、pdx-1和neurod-1的時空表達。進行高糖脅迫后，腹部輪廓高糖組比對照組染色減弱很多(圖4A1，B1)，加入金線蓮醇提物后，隨著醇提物濃度的升高，pck-1的染色部位顏色逐漸變深，并且具有濃度依賴性，在金線蓮醇提物濃度為400 μg/mL時基本恢復到了對照組的水平(圖4C1-E1)。高糖組pdx-1在腹部胰腺部位染色明顯比對照組淺(圖4A2，B2)，加入金線蓮醇提物之后，pdx-1在腹部胰腺部位染色隨著醇提物濃度的升高逐漸變深(圖4C2-E2)。而neurod-1染色情況則與pck-1和pdx-1相反，高糖組頭部和頸部的染色相比于對照組增加了很多(圖4A3，B3)，加入金線蓮醇提物之后，隨著金線蓮醇提物濃度的升高，neurod-1的染色部位顏色逐漸變淺，在濃度為500 μg/mL時，neurod-1的染色基本恢復到了對照組的水平(圖4C3～E3)。由此我們得出結論：在高糖模型下，高葡萄糖溶液抑制pck-1和pdx-1基因表達的情況下，金線蓮醇提物可以促進pck-1和pdx-1基因的時空表達，與上述半定量PCR結果一致，金線蓮醇提物對neurod-1基因的時空表達有抑制作用。

注：(a)金線蓮醇提物。圖4　金線蓮醇提物對pck-1、pdx-1和neurod-1時空表達的影響Note:(a)Anoectochilus roxburghii alcohol extracts.Fig.4　The spatial and temporal expression patterns of pck-1, pdx-1and neurod-1 after treated with Anoectochilus roxburghii alcohol extracts in zebrafish

3　討論

斑馬魚作為一種新興的模式生物，具有體型小、易飼養、繁殖周期短等其他模式生物不具備的優點，而且在器官和基因序列上與人類都很相似，所以很多實驗室現在用斑馬魚來研究糖尿病。本研究利用斑馬魚來篩選金線蓮具有降血糖的活性組分，實驗結果表明，對斑馬魚幼魚進行高糖脅迫，加入金線蓮醇提物組與加入其他兩種組分(小分子多糖和大分子多糖)的斑馬魚相比較，加入金線蓮醇提物組斑馬魚幼魚組織液內的葡萄糖濃度明顯下降，初步篩選出具有降糖作用的活性組分為金線蓮醇提物。接下來進行了初步的機理研究，本研究通過半定量PCR以及整胚原位雜交技術檢測了四個糖代謝相關基因mRNA的表達水平，發現insulin、pck-1、pdx-1基因在加了高糖溶液之后基因表達量與對照組相比下降非常顯著，并且Insulin基因的時空表達發生了偏移，但是經過金線蓮醇提物處理后insulin、pck-1、pdx-1基因的表達量與只加葡萄糖組相比明顯上升，并且insulin基因的時空表達偏移率明顯下降(圖2～4)，而neurod-1基因mRNA表達則與上述三個基因恰恰相反。我們推測高糖脅迫情況下會抑制pdx-1基因的表達[26]，加入金線蓮醇提物后可以促進pdx-1基因的正常表達來維持β細胞的形態和正常功能，促進insulin基因的正常表達，insulin基因的時空表達偏移率明顯下降。另一方面，金線蓮醇提物可以促進pck-1基因的正常表達維持機體葡萄糖的穩態。加入金線蓮醇提物后neurod-1基因mRNA表達量下降有待進一步探究。

本研究尚存在改進之處，金線蓮降血糖成分不夠明確，具體是哪種物質起到降血糖的作用，還需要通過分離純化進一步確定，此外金線蓮醇提物是通過哪種信號途徑起到降血糖作用，這些問題都需要進一步研究。

參考文獻：