注射用骨肽對去卵巢骨質疏松大鼠骨微結構、骨密度和骨生物力學性能的影響

韓　龍，吳水培

(1.安徽醫科大學解放軍九八臨床學院，浙江 湖州　313000； 2.解放軍九八醫院，浙江 湖州　313000)

絕經后婦女因卵巢功能衰退，雌激素嚴重缺乏，骨吸收大于骨形成，易出現骨質疏松，表現為骨強度受損、骨組織顯微結構退后和骨折危險性增加，骨質疏松可導致患者活動能力下降、軀體疼痛，嚴重者可導致骨折，嚴重影響患者的生活質量和生命安全[1]。目前西醫治療絕經后骨質疏松主要方法為抑制骨吸收和促進骨形成，激素替代療法是常用的治療方式，但激素替代可增加患者子宮內膜癌和血栓發生的風險，降低了患者治療的依從性[2]。注射用骨肽是含有多種骨代謝的活性肽類，具有調節骨代謝、刺激成骨細胞增殖，調節鈣磷代謝，促進新骨形成，防治骨質疏松和促進骨折愈合等效果，是治療骨質疏松的常用藥物[3]。研究顯示，鈣吸收障礙和營養物質生物利用度降低也是導致骨質疏松的重要因素，腸道鈣吸收以主動吸收為主，需要鈣調節蛋白(CaBp-D9K)協助，CaBp-D9K活性降低可導致鈣吸收障礙，導致骨質疏松發生，提高腸鈣吸收率是防治絕經后骨質疏松的重要途徑[4]。目前較少見注射用骨肽對CaBp-D9K影響的報道，本研究通過對注射用骨肽干預下觀察去卵巢骨質疏松大鼠CaBp-D9KmRNA表達、骨密度、骨生物力學性能的變化，進一步探討注射用骨肽治療絕經后骨質疏松的作用機制，現將結果報告如下。

1　材料和方法

1.1　實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體重180～230 g，3月齡，由安徽醫科大學實驗動物中心提供 [SCXK(皖)2017-0018]，在安徽醫科大學實驗動物中心進行實驗[SYXK(皖)2017-0124]，自由進食飲水，保持12 h晝夜節律，室溫22℃～25℃，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷，安徽醫科大學實驗倫理委員會批號：2017-0024。適應性飼養1周后進行建模，采用隨機數字表法，選取24只SD大鼠作為空白組，不接受干預治療；選取24只SD大鼠作為假手術組；在建模成功后隨機選取48只SD大鼠分為2組，模型組和觀察組，每組24只。空白組、假手術組、模型組給予生理鹽水灌胃，觀察組給予注射用骨肽灌胃。

1.2　主要試劑及儀器

注射用骨肽購自黑龍江珍寶島藥業股份有限公司，規格：10 mg多肽；1,25(OH)2D3酶聯免疫試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；cDNA反轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；CaBP-D9k、β-actin引物序列由大連寶公司合成。

Discovery-A骨密度儀購自美國好樂杰公司；高速離心機購自長沙湘銳離心機有限公司；Genios多功能酶標儀購自奧地利Tecan公司；RG-3000 Real-Time PCR儀購自北京照生行儀器設備有限公司； AG-IC20KN萬能材料實驗機購自島津儀器蘇州有限公司。

1.3　實驗方法

1.3.1模型的建立

空白組不予以處理，模型組和觀察組參照文獻[5]，在SD大鼠適應性飼喂1周后，對大鼠進行建模，采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背部正中切口，進入腹腔背側，完整切除雙側卵巢，假手術組同樣采用3%戊巴比妥鈉麻醉，背部正中切口，進入腹腔背側，切除小段腸系膜。術后均給予抗生素3 d預防感染。術后大鼠飼養條件同術前。

當改變煤體內孔隙壓力分布后，裂隙偏向孔隙壓力較高的方向擴展，其擴展方向與最大主應力方向的夾角大小可以反映出控制孔導控作用的強弱。如圖8所示，控制水壓為10 MPa時，裂隙偏角最大并與控制孔貫通，之后地應力占據主導作用，裂隙逐漸沿垂直最小主應力方向延伸，如圖8d所示。

1.3.2藥物干預

建模3個月后對實驗動物進行干預，觀察組：注射用多肽成人每日劑量10 mg，按60 kg計算，為0.17 mg/kg，大鼠等效劑量按成人每日用藥量的6.3倍計算為1.07 mg/kg，取1.1 mg/kg，溶于1 mL生理鹽水腹腔注射。模型組、假手術、空白組給予等量生理鹽水腹腔注射。連續干預2個月。

1.3.3骨顯微結構和骨密度檢測

藥物干預結束后采用micro-CT掃描股骨頭至股骨中段，獲取骨體積(BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)等參數；骨顯微結構完成后采用Discovery-A骨密度儀檢測股骨骨密度。

1.3.4血清1,25(OH)2D3和骨生物力學

大鼠麻醉后行腹主動脈取血，4℃靜置20 min，3000 r/min離心20 min，取上清液，保存于-80℃冰箱，采用酶聯免疫吸附法檢測血清1,25(OH)2D3水平；分離大鼠左側股骨采用三點彎曲實驗[6]記錄股骨最大載荷(指股骨斷裂前所能承受的最大力)和斷裂載荷值(股骨斷裂時所承受的力)。

1.3.5小腸鈣結合蛋白(CaBp-D9K)mRNA表達測定

取十二指腸以下10 cm小腸，無菌生理鹽水沖洗干凈，縱行剪開腸腔，刮下腸黏膜，采用Trizol法提取小腸組織總RNA，在反轉錄酶M-MLV作用下，將mRNA反轉錄成cDNA，采用RG-3000 real-time PCR儀擴增，反應條件：95℃ 2 min，95℃ 10 s，60℃ 40 s，40個循環，引物序列見表1。

1.4　統計學方法

2　結果

2.1　股骨顯微結構參數的比較

空白組和假手術組BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp水平相比較差異均無顯著性(P> 0.05)；模型組BV、Tb.Th、Tb.N水平低于空白組和假手術組，Tb.Sp高于空白組和假手術組，觀察組BV、Tb.Th、Tb.N水平低于模型組，Tb.Sp高于模型組，差異均有顯著性(P< 0.05)。(見表2和圖1)

2.2　骨密度和骨生物力學的比較

空白組和假手術組骨密度、最大載荷、斷裂載荷相比較差異均無顯著性(P> 0.05)；模型組骨密度、最大載荷、斷裂載荷均顯著低于空白組和假手術組(P< 0.05)；觀察組骨密度、最大載荷、斷裂載荷均顯著低于模型組(P< 0.05)。(見表3)

表1　CaBp-D9K和β-actin引物序列

表2　四組大鼠股骨顯微結構參數相比較(n=24)

注：與空白組相比較，aP< 0.05；與假手術組相比較，bP< 0.05；與模型組相比較，cP< 0.05。

Note. Compared with the blank group,aP< 0.05. Compared with the sham operation group,bP< 0.05. Compared with the model group,cP< 0.05.

圖1　四組大鼠股骨顯微結構的micro-CT圖像Fig.1　Micro-CT images of the microstructure of the femur of the four rat groups

組別Groups骨密度(g/cm2)Bone Density最大載荷(N)Maximum Load斷裂載荷(N)Breaking Load空白組Blank Group0.258±0.01733.738±2.38259.644±3.518假手術組Sham Operation Group0.253±0.02132.846±2.42358.859±4.136模型組Model Group0.218±0.026ab20.541±3.609ab45.261±2.634ab觀察組Observation Group0.238±0.019abc27.457±2.810abc53.868±3.714abc

注：與空白組相比較，aP< 0.05；與假手術組相比較，bP< 0.05；與模型組相比較，cP< 0.05。

Note. Compared with the blank group,aP< 0.05. Compared with the sham operation group,bP< 0.05. Compared with the model group,cP< 0.05.

表4　四組血清1,25(OH)2D3和小腸CaBp-D9K mRNA表達相比較(n=24)

注：與空白組相比較，aP< 0.05；與假手術組相比較，bP< 0.05；與模型組相比較，cP< 0.05。

Note. Compared with the blank group,aP< 0.05. Compared with the sham operation group,bP< 0.05. Compared with the model group,cP< 0.05.

2.3　血清1,25(OH)2D3和小腸CaBp-D9K mRNA表達的比較

空白組和假手術組血清1,25(OH)2D3和小腸CaBp-D9KmRNA表達相比較差異均無顯著性(P> 0.05)；模型組血清1,25(OH)2D3和小腸CaBp-D9K mRNA表達均低于空白組和假手術組，觀察組血清1,25(OH)2D3和小腸CaBp-D9K mRNA表達均低于模型組，差異均有顯著性(P< 0.05)。(見表4)

3　討論

腸道鈣的吸收包括被動擴散過程和主動跨細胞過程，主動跨細胞轉運過程是腸道鈣的吸收主要方式，需要CaBp-D9K協助完成轉運過程。CaBp-D9K分子量為9000，是受活性維生素D調節的鈣轉運蛋白，其主要功能是提高維生素D依賴性細胞內鈣轉運，增加鈣離子通過細胞彌散的速度，使鈣離子快速從細胞頂端到達基底側，因此小腸CaBp-D9K含量與腸道鈣吸收能力成正比[7]。絕經女性雌激素水平降低可導致繼發性甲狀旁腺和維生素D合成減少，導致腸道功能缺陷，隨著年齡增加，腸黏膜CaBp-D9K表達逐漸降低，70歲的人較其青年時期的CaBp-D9K降低超過50%，因此，CaBp-D9K表達降低是絕經后骨質疏松高發的重要因素[8]。1,25(OH)2D3是維生素D3的活性代謝產物，可與維生素D受體結合調控CaBp-D9K活性，外源性1,25(OH)2D3補充可增加CaBp-D9K基因轉錄[9]。

本研究采用去卵巢大鼠復制女性絕經后骨質疏松動物模型。去卵巢后實驗動物體內雌激素水平降低，骨吸收增強，骨生長減弱，骨量丟失，逐步形成骨質疏松模型。本研究結果顯示，模型組骨密度、最大載荷、斷裂載荷、BV、Tb.Th、Tb.N水平低于空白組和假手術組；Tb.Sp高于空白組和假手術組；觀察組骨密度、最大載荷、斷裂載荷、BV、Tb.Th、Tb.N水平均高于對照組，Tb.Sp低于模型組。結果提示，注射用骨肽可促進去卵巢骨質疏松大鼠骨量增加，骨小梁連接更為緊密，對去卵巢所致骨質疏松具有良好的治療作用，與有關研究[10]一致。本研究結果顯示，模型組血清1,25(OH)2D3水平和小腸CaBp-D9k mRNA表達均顯著低于空白組和假手術組，提示腸黏膜CaBp-D9k mRNA表達降低所致鈣吸收障礙可能是去卵巢大鼠骨質疏松發生的重要因素，與有關研究[8-9]一致。本研究結果同時顯示，觀察組血清1,25(OH)2D3水平和小腸CaBp-D9k mRNA表達均高于模型組，提示注射用骨肽可通過提高1,25(OH)2D3水平，增加小腸CaBp-D9k mRNA表達，促進腸道鈣吸收。

綜上所述，注射用骨肽可降低去卵巢大鼠骨質疏松程度，增加小腸CaBp-D9k mRNA表達，促進腸鈣吸收可能是其重要作用機制。