黑豆皮中花青素與鐵離子的相互作用

謝巖黎，王 威，朱曉路

（河南工業大學糧油食品學院，河南省糧油食品安全檢測重點實驗室，河南 鄭州 450001）

花青素是一種天然、顏色鮮艷、水溶性色素，屬于酚類化合物中的黃酮類化合物[1]。花青素廣泛存在于花、果實的組織以及豆類表皮細胞中，是構成果實顏色重要組成部分[2]。黑豆皮中花青素含量豐富，在水中有極好的溶解度，在酸性條件下有良好的穩定性，能夠在酸性熱醇條件下提取出來[3]。花青素具有多種生物活性，能有效抑制低密度脂蛋白的氧化，降低血清及肝臟中脂肪含量，降低心血管病發率[4]；由于其抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶，對2-型糖尿病的早期治療有重要作用[5]；抑制胰脂肪酶活性控制肥胖[6]；具有抗氧化及清除自由基的能力[7]；適用于食品添加劑、著色劑和保健類藥物的研究與開發，在食品行業和醫藥領域有廣闊的發展前景[8]。

鐵缺乏癥是全球性的營養缺乏性疾病，高缺鐵貧血率主要在于通過飲食攝入的鐵不足，生物利用率低[9]。自然界中鐵的存在形式主要包括二價鐵Fe（II）和三價鐵Fe（III），Fe（II）較Fe（III）更易被人體吸收，Fe（III）在弱酸及中性條件下低的溶解度限制了其在小腸內的吸收。花青素作為酚類物質的一種，具有與金屬離子絡合的共性，在生理條件下，鐵可通過形成螯合鐵來維持它的溶解度，促進了膳食鐵在人體內的吸收[10-12]。有研究表明，植物多酚的金屬結合能力能有效地保護Fe（II）自氧化，改善Fe（III）的溶解度及其在小腸內的吸收[13-14]。花青素與金屬離子的相互作用使得植物、水果具有各種各樣的顏色，金屬離子有助于提高花青素顏色的穩定性[15]。而花青素可以和鐵離子形成穩定的復合物，應用于食品色素等[16]，這對于調節身體鐵代謝有重要影響。本實驗通過紫外-可見光譜、熒光光譜研究花青素提取液與鐵離子在不同pH值條件下的相互作用機制，并對花青素提取液對Fe（II）離子穩定性和Fe（III）離子溶解度的影響進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花青素提取液由本實驗室自制；東北有機青仁黑豆上海頤生農產品有限公司；黑豆洗凈、烘干、脫皮，粉碎后過40 目篩。將黑豆皮粉末與60%乙醇溶液（pH 1.0）料液比為1∶25（g/mL）混合，50 ℃超聲20 min。收集所得提取溶液，抽濾，40 ℃旋轉蒸發濃縮，定容后利用高效液相色譜儀測定，其主要成分為矢車菊素-3-葡萄糖苷，含量為6.965 mg/g[17-18]。

無水乙醇、乙酸 天津市天力化學試劑有限公司；鄰菲啰啉、氯化鉀、無水乙酸鈉、FeSO4·7H2O（Fe（II））、FeCl3·6H2O（Fe（III））、無水乙酸鈉、鹽酸羥胺、抗壞血酸 天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

101型電熱鼓風干燥箱、FW-80高速萬能粉碎機北京市永光明醫療儀器廠；電子分析天平 Mettler Toledo儀器（上海）有限公司；KQ-100E超聲波清洗器昆山市超聲波儀器有限公司；UV-6100S雙光束紫外-可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司；Cary Eclipse熒光分光光度計 美國Varian公司；PHS-3C型精度pH計上海雷磁科學儀器股份有限公司；RE-6000A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（III）循環水式真空泵 鄭州科豐儀器設備有限公司；QL-861渦旋振蕩器海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素的全波長掃描

將實驗室制備的花青素提取液在200～600 nm范圍內掃描紫外-可見光譜。

1.3.2 紫外-可見光譜

取1.3.1節中實驗室制備的花青素提取液與對應pH值條件下不同濃度鐵離子（Fe（II）和Fe（III））溶液等體積混合，使得混合溶液中花青素（矢車菊素-3-葡萄糖苷）的濃度為0.2 mmol/L，鐵離子的濃度分別為0.05、0.07、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mmol/L和1.60 mmol/L。待反應平衡1 h后，采用紫外-可見分光光度計進行光譜掃描，掃描波長范圍為200～600 nm，記錄光譜。同樣條件下，測定4 組pH值（1.0、3.5、5.0、7.3）環境下的光譜變化。

1.3.3 熒光光譜

花青素-鐵離子復合物中，花青素濃度為0.2 mmol/L，花青素與鐵離子物質的量比分別為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和1∶8。采用熒光分光光度計進行熒光光譜掃描，其中激發光波長為275 nm，發射波長為300～400 nm，狹縫寬度為10 nm，記錄熒光強度的變化。同樣條件下，測定4 組pH值（1.0、3.5、5.0、7.3）環境下的光譜變化。

1.3.4 花青素對Fe（II）的穩定性的影響

與抗壞血酸對比抗氧化性。配制0.1 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，實驗分成3 組：抗壞血酸與Fe（II）物質的量比為2∶1；花青素提取液與Fe（II）物質的量比為2∶1；空白硫酸亞鐵溶液。將3 組溶液置于50 mL棕色容量瓶中常溫保存，每隔24 h采用鄰二氮菲法測定溶液中Fe（II）的保留率。

1.3.5 花青素對Fe（III）溶解度的影響

用蒸餾水配制50 mmol/L的三氯化鐵溶液作為儲備液，用蒸餾水稀釋成如下濃度梯度：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 mmol/L。配制花青素-Fe（III）混合溶液，使得花青素最終濃度為0.2 mmol/L，鐵離子的最終濃度分別為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 mmol/L。在室溫條件下放置2 h后，10 800×g離心20 min。取上清液，加入10 mL具塞試管中，采用鄰二氮菲法測定上清液中鐵的含量，依次表征Fe（III）在不同濃度時的溶解度以及花青素提取液對Fe（III）溶解度的影響。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

將黑豆皮花青素的提取液稀釋，用紫外-可見分光光度計在波長200～600 nm范圍內全波長掃描。掃描光譜如圖1所示，分別在280 nm和520 nm波長處有兩個明顯的吸收峰，其中520 nm為花青素類物質的特征吸收峰，280 nm波長處為多酚類化合物的特征吸收峰[18-19]，以下實驗中對黑豆皮中花青素含量的測定均采用最大吸收波長為520 nm。

圖1 黑豆皮花青素提取液的紫外-可見光譜掃描（200～600 nm）Fig.1 UV-vis spectra of anthocyanins extracted from black bean coats(200–600 nm)

2.2 花青素與鐵離子相互作用的紫外-可見光譜分析

圖2 黑豆皮花青素提取液與鐵離子Fe（II）、Fe（III）在pH 1.0、3.0、5.0和7.3時的相互作用紫外-可見吸收光譜Fig.2 The presence of iron ions changed the UV-visible absorption spectra of anthocyanins at different pH values

由圖2可以看出，黑豆皮花青素提取液在pH 1.0條件下在520 nm和280 nm波長處有最大吸收，Fe（II）離子的加入對花青素提取液的紫外-可見光譜無明顯作用，而Fe（III）離子對花青素提取液的紫外-可見光譜有明顯影響，隨著鐵離子濃度的增加，520 nm波長處的吸光度逐漸降低，而在280 nm波長處的吸光度值逐漸升高且該處吸收峰出現紅移現象，源于兩者的相互作用[20]。當加入花青素提取液與Fe（III）離子物質的量比為1∶4時，280 nm波長處已無吸收峰；pH 3.0時，Fe（II）離子對花青素提取液的吸收光譜有輕微作用，520 nm波長處的吸收峰無明顯變化，280 nm波長處的吸收峰隨著Fe（II）溶液濃度的增加，峰值逐漸升高，而Fe（III）離子對花青素提取液的吸收光譜影響同樣集中在280 nm波長處的吸收光譜，280 nm波長處的吸收峰隨著Fe（III）溶液濃度的增大，峰值升高，且升高幅度遠大于Fe（II）對提取液吸收光譜的作用，當物質的量比為1∶8時，280 nm波長處已無明顯吸收峰；在pH 5.0條件下，花青素提取液在520 nm波長處的吸收峰減弱，隨著Fe（II）、Fe（III）濃度的增加，吸收光譜強度增大，Fe（II）的加入對280 nm吸收峰無明顯影響，而Fe（III）的加入使得280 nm波長處的吸收峰逐漸趨于平坦至無明顯吸收峰；在pH 7.3時，花青素提取液在520 nm波長處無峰值，鐵離子的加入使提取液的吸收光譜強度逐漸升高，說明鐵離子對花青素有輔色作用，生成了具有顏色的復合物[21]。

2.3 花青素與鐵離子相互作用的熒光光譜分析

圖3 黑豆皮花青素提取液與Fe（II）、Fe（III）在pH 1.0、3.0、5.0、7.3時的相互作用熒光淬滅光譜Fig.3 The presence of iron ions changed the fl uorescence quenching spectra of anthocyanins at different pH values

熒光淬滅是研究熒光物質與淬滅劑相互作用的重要手段[22]。研究花青素的熒光淬滅過程能夠得到花青素與鐵離子相互作用的結合常數等信息。當一些小分子物質加入到含熒光物質的溶液形成復合物后，熒光強度降低，發生熒光淬滅現象。花青素的熒光基團主要來自于其發色基團-糖苷配體[23]。

圖3為Fe（II）離子和Fe（III）離子在pH 1.0、3.0、5.0和7.3條件下和花青素的熒光淬滅光譜。激發波長為275 nm時，花青素的最大發射峰為320 nm。隨著鐵離子濃度的增加，溶液的熒光強度逐漸降低，說明鐵離子對花青素有熒光淬滅作用，表明鐵離子與花青素形成了復合物，花青素B環上的鄰位羥基結構直接參與與金屬離子的螯合[21,24-25]。隨著pH值的升高，不添加鐵離子的花青素溶液的熒光強度從48.43降低到28.85。這是因為花青素的結構隨著pH值的改變而改變，花青素在低pH值條件下更加穩定[26]。添加鐵離子后，當pH 1.0時，Fe（III）離子對花青素的淬滅作用較明顯，而Fe（II）離子對花青素幾乎沒有淬滅作用；當pH 3.0時，Fe（III）離子和Fe（II）離子均對花青素表現出明顯的淬滅作用；當pH 5.0時，Fe（III）離子和Fe（II）離子對花青素均表現出一定的淬滅作用；當pH 7.3時，Fe（III）離子和Fe（II）離子對花青素的淬滅作用明顯降低。由此得出，pH值小于7.3時，Fe（II）離子對花青素的淬滅作用隨著pH值的升高而增大，Fe（III）離子對花青素的淬滅作用隨著pH值的升高而降低[27]。

2.4 花青素對Fe（II）的穩定性的影響

抗氧化功能是黑豆皮中花青素的主要作用之一，自然界中鐵主要以Fe（III）的形式存在，因Fe（II）在空氣中極易被氧化變成Fe（III）[28]。常用于保護鐵離子氧化的有抗壞血酸以及其衍生物，本實驗采用抗壞血酸做為對比，考察花青素對Fe（II）離子穩定性的影響。如圖4所示，Fe（II）在不加抗氧化劑的時候極易被氧化，僅10 d內，其Fe（II）離子含量降低了約47%，1 個月之內，僅有45%的鐵離子以Fe（II）的形式存在。加入抗壞血酸后，Fe（II）得到了較好的保護，在實驗期間，88.11%鐵離子以Fe（II）離子的形式存在，相對于抗壞血酸，花青素提取液對Fe（II）離子具有更好的保護作用，實驗的3 個階段性數據表明，花青素對鐵離子的抗氧化能力優于抗壞血酸，只有不到9%的鐵離子被氧化。由此可知，進一步驗證了花青素可以作為抗氧化劑來使用以保護Fe（II）離子被氧化，使鐵離子避免參與芬頓反應，不與氧發生反應，改變了氧化還原電勢，從而抑制Fe（II）被氧化成Fe（III）[29-30]。

圖4 黑豆皮花青素提取液和抗壞血酸對Fe（II）穩定性的影響Fig.4 Effect of anthocyanins extracted from black bean coats and VC on stability of Fe (II)

2.5 花青素對Fe（III）的溶解度的影響

圖5 黑豆皮花青素提取液對Fe（III）溶解度的影響Fig.5 Effect of anthocyanins extracted from black bean coats on solubility of Fe(III)

由圖5可以看出，當溶液中Fe（III）的濃度小于10 mmol/L時，僅10%左右的Fe（III）存在于上清液中，當濃度繼續增加時，Fe（III）的溶解度隨著濃度的增大而增大，至接近于80%。Fe（III）的低溶解度主要因為，在實驗環境中，生成了氫氧化合物的緣故。此外，在實驗中放置的2 h期間，溶液接觸空氣也加速了Fe（III）離子的沉淀反應。鐵離子在酸性條件下比較穩定。總的來說，花青素的加入使鐵離子形成螯合鐵，從而使Fe（III）離子的溶解度得到了顯著改善。在0～10 mmol/L Fe（III）離子濃度范圍內，約90%的鐵以溶解狀態存在于上清液中；說明黑豆皮花青素提取液對Fe（III）離子有增溶作用。

3 結 論

本實驗通過紫外-可見光譜、熒光光譜分析對黑豆皮花青素提取液與Fe（II）/Fe（III）在不同pH值條件下的相互作用進行研究。紫外-可見光譜表明鐵離子能夠影響花青素的紫外-可見吸收光譜，并且具有pH值依賴行為；熒光光譜的分析表明鐵離子對花青素的熒光具有淬滅作用，且淬滅效率隨著pH值的改變而改變；黑豆皮花青素能與Fe（II）/Fe（III）發生相互作用，在一定物質的量比下可形成可溶性的絡合物；花青素提取液對Fe（II）離子的穩定性有很好的保護作用，抑制Fe（II）氧化成Fe（III）。不同濃度的Fe（III）離子在溶液中的溶解度不同，低濃度時溶解度極低，花青素能夠有效地提高Fe（III）離子的溶解度。黑豆皮中花青素提取液表現了很強的還原力，且其安全性高、穩定性好，適用于食品添加劑、著色劑和保健類藥物的研究與開發，在食品行業和醫藥領域有廣闊的發展前景。

[1] ARACELI C, MADELOURDES P H, MAELENA P, et al. Chemical studies of anthocyanins∶ a review[J]. Food Chemistry, 2009, 113(4)∶859-871. DOI∶10.1016/j.foodchem.2008.09.001.

[2] YOUSUF B, GUL K, WANI A A, et al. Health benef i ts of anthocyanins and their encapsulation for potential use in food systems∶ a review[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2016, 13∶ 2223-2230.DOI∶10.1080/10408398.2013.805316.

[3] CHOUNG M G, BAEK I Y, KANG S T, et al. Isolation and determination of anthocyanins in seed coats of black soybean (Glycine max (L.) Merr.)[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2001,49(12)∶ 5848-5851. DOI∶10.1021/jf010550w.

[4] TAKAHASHI R, OHMORI R, KIYOSE C, et al. Antioxidant activities of black and yellow soybeans against low density lipoprotein oxidation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005,53(11)∶ 4578-4582. DOI∶10.1021/jf048062m.

[5] MOJICA L, MEYER A, BERHOW M A, et al. Bean cultivars(Phaseolus vulgaris L.) have similar high antioxidant capacity, in vitro inhibition of α-amylase and α-glucosidase while diverse phenolic composition and concentration[J]. Food Research International, 2015,69∶ 38-48. DOI∶10.1016/j.foodres.2014.12.007.

[6] FABRONI S, BALLISTRERI G, AMENTA M, et al. Screening of the anthocyanin profile and in vitro, pancreatic lipase inhibition by anthocyanin-containing extracts of fruits, vegetables, legumes and cereals[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 2016, 96(14)∶4713-4723. DOI∶10.1002/jsfa.7708.

[7] XU B J, CHANG S K. Antioxidant capacity of seed coat, dehulled bean, and whole black soybeans in relation to their distributions of total phenolics, phenolic acids, anthocyanins, and isoflavones[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(18)∶ 8365-8373.DOI∶10.1021/jf801196d.

[8] 徐春明, 龐高陽, 李婷. 花青素的生理活性研究進展[J]. 中國食品添加劑, 2013(3)∶ 205-210. DOI∶10.3969/j.issn.1006-2513.2013.03.028.

[9] TRIPATHI B, PLATEL K. Iron fortification of finger millet(Eleucine coracana) flour with EDTA and folic acid as cofortif i cants[J]. Food Chemistry, 2011, 126(2)∶ 537-542. DOI∶10.1016/j.foodchem.2010.11.039.

[10] MORI M, KONDO T, TOKI K, et al. Structure of anthocyanin from the blue petals of Phacelia campanularia and its blue flower color development[J]. Phytochemistry, 2006, 67(6)∶ 622-629. DOI∶10.1016/j.phytochem.2005.12.024.

[11] YOSHIDA K, KITAHARA S, ITO D, et al. Ferric ions involved in the fl ower color development of the Himalayan blue poppy, Meconopsis grandis[J]. Phytochemistry, 2006, 67(10)∶ 992-998. DOI∶10.1016/j.phytochem.2006.03.013.

[12] SHOJI K, MIKI N, NAKAJIMA N, et al. Perianth bottom-specif i c blue color development in Tulip cv. Murasakizuisho requires ferric ions[J].Plant & Cell Physiology, 2007, 48(2)∶ 243-251. DOI∶10.1093/pcp/pcl060.

[13] CHVáTALOVá K, SLANINOVá I, B?EZINOVá L, et al.Influence of dietary phenolic acids on redox status of iron∶ ferrous iron autoxidation and ferric iron reduction[J]. Food Chemistry, 2008,106(2)∶ 650-660. DOI∶10.1016/j.foodchem.2007.06.028.

[14] PALIKA R, MASHURABAD P C, NAIR M K, et al. Characterization of iron-binding phosphopeptide released by gastrointestinal digestion of egg white[J]. Food Research International, 2015, 67∶ 308-314.DOI∶10.1016/j.foodres.2014.11.049.

[15] KUNSáGI-MáTé S, ORTMANN E, KOLLáR L, et al. Effect of ferrous and ferric ions on copigmentation in model solutions[J].Journal of Molecular Structure, 2008, 891(1/2/3)∶ 471-474.DOI∶10.1016/j.molstruc.2008.04.036.

[16] BUCHWEITZ M, BRAUCH J, CARLE R, et al. Application of ferric anthocyanin chelates as natural blue food colorants in polysaccharide and gelatin based gels[J]. Food Research International, 2013, 51∶274-282. DOI∶10.1016/j.foodres.2012.11.030.

[17] GIUSTI M M, WROLSTAD R E. Characterization and measurement of anthocyanins by UV-visible spectroscopy[M]//WROLSTAD R E, SCHWARTZ S J. Current protocols in food analytical chemistry.New York∶ John Wiley and Sons, 2001. DOI∶10.1002/0471142913.faf0102s00.

[18] XIE Y L, ZHU X L, LI Y, et al. Analysis of the pH dependent Fe(III)ion chelating activity of anthocyanin extracted from black soybean[Glycine max (L.) Merr.] coats[J]. Agricultural and Food Chemistry,2018, 66(5): 1131-1139. DOI:10.1021/acs.jafc.7b04719.

[19] JIA N, SHU Q Y, WANG D H, et al. Identif i cation and characterization of anthocyanins by high-performance liquid chromatographyelectrospray ionization-mass spectrometry in herbaceous peony species[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science,2008, 133(3): 418-426.

[20] KOLEY SETH B, RAY A, et al. Structure dependent hydrophobic and hydrophilic interactions between nickel (II) Schiff base complexes and serum albumins: spectroscopic and docking studies[J]. Journal of Luminescence, 2016, 171: 85-97. DOI:10.1016/j.jlumin.2015.11.009.

[21] KOHNO Y, KATO Y, SHIBATA M, et al. Enhanced stability of natural anthocyanin incorporated in Fe-containing mesoporous silica[J]. Microporous and Mesoporous Materials, 2015, 203: 232-237.DOI:10.1016/j.micromeso.2014.10.042.

[22] ZHANG Y, SHI S, SUN X, et al. Structure-affinity relationship of bovine serum albumin with dietary flavonoids with different C-ring substituents in the presence of Fe3+ion[J]. Food Research International,2011, 44(9): 2861-2867. DOI:10.1016/j.foodres.2011.06.045.

[23] DRABENT R, PLISZKA B, OLSZEWSKA T. Fluorescence properties of plant anthocyanin pigments. I. Fluorescence of anthocyanins in Brassica oleracea L. extracts[J]. Journal of Photochemistry &Photobiology B Biology, 1999, 50(1): 53-58. DOI:10.1016/S1011-1344(99)00070-6.

[24] BUCHWEITZ M, NAGEL A, CARLE R, et al. Characterisation of sugar beet pectin fractions providing enhanced stability of anthocyanin-based natural blue food colourants[J]. Food Chemistry,2012, 132: 1971-1979. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.12.034.

[25] LI D J, ZHU M, XU C, et al. The effect of Cu2+or Fe3+on the noncovalent binding of rutin with bovine serum albumin by spectroscopic analysis[J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2011, 78(1): 74-79. DOI:10.1016/j.saa.2010.08.069.

[26] REYES L F, CISNEROS-ZEVALLOS L. Degradation kinetics and colour of anthocyanins in aqueous extracts of purple- and red-flesh potatoes (Solanum tuberosum L.)[J]. Food Chemistry, 2007, 100(3):885-894. DOI:10.1016/j.foodchem.2005.11.002.

[27] AL B S, MORA N, LOONIS M, et al. Chemically synthesized glycosides of hydroxylatedflavylium ions as suitable models of anthocyanins: binding to iron ions and human serum albumin,antioxidant activity in model gastric conditions[J]. Molecules, 2014,19(12): 20709-20730. DOI:10.3390/molecules191220709.

[28] ILBERT M, BONNEFOY V. Insight into the evolution of the iron oxidation pathways[J]. Biochimica et Biophysica Acta(BBA): Bioenergetics, 2013, 1827(2): 161-175. DOI:10.1016/j.bbabio.2012.10.001.

[29] WINTERBOURN C C. Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction[J]. Toxicology Letters, 1995, 82/83(6): 969-974.DOI:10.1016/0378-4274(95)03532-X.

[30] KHOKHAR S, APENTEN R O. Iron binding characteristics of phenolic compounds: some tentative structure-activity relations[J].Food Chemistry, 2003, 81(1): 133-140. DOI:10.1016/S0308-8146(02)00394-1.