蓮原花青素低聚體在模擬生理環境下對非酶糖化末端產物的抑制作用

閔瑤瑤，周夢舟，柳志杰，馮年捷*，吳 茜,*

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院，工業發酵湖北省協同創新中心，湖北省食品發酵工程技術研究中心，湖北 武漢 430068；2.湖北工業大學材料與化學工程學院，湖北 武漢 430068）

非酶糖化反應，又稱Maillard反應[1]，該反應使蛋白質發生交聯而失去活性，生成不可逆的非酶糖化末端產物（advanced glycation end products，AGEs）。AGEs在體內大量積累可導致糖尿病[2]、腎病（尿毒癥）[3]、動脈粥樣硬化[4]、衰老和阿茨海默爾[5]等疾病的發生。研究表明[6]，大部分過渡金屬離子（Fe3+、Fe2+、Cu2+、Zn2+）都能有效地促進非酶糖化反應的進行，而Cu2+和Zn2+只在低質量濃度（1～5 mg/L）下有促進作用，當其質量濃度達到5～25 mg/L時，反而對非酶糖化反應有一定的抑制作用，此外部分非過渡金屬如Ca2+和Mg2+則會對反應有一定的抑制作用[7]。黃酮類化合物是一類重要的天然產物，其母核為2-苯基色原酮，具有清除自由基、抗癌以及防治心血管疾病等功效[8-9]。研究表明，蘆丁、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）等黃酮類化合物對于生理條件下非酶糖化反應有較強的抑制作用[10-11]。

從蓮科植物蓮的成熟花托即蓮房中提取的蓮原花青素（oligomeric procyanidins of lotus seedpod，LSOPC），用乙醇提取并用乙酸乙酯萃取的LSOPC的主要成分為兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素及其二、三、四聚體，其單體以兒茶素為主[12]。無論在體內外，LSOPC均有很好的抗氧化、螯合金屬離子及消除自由基的功能[13-14]，并有研究顯示原花青素能在體外清除Maillard反應的中間產物——活性羰基[15-16]。故LSOPC可能是一種較好的體內外AGEs抑制劑，本實驗從模擬生理環境驗證LSOPC對AGEs的抑制效果，并尋找更有效的AGEs復配抑制劑，以此為體內的AGEs生成抑制及相關慢性疾病的外源膳食補充劑或新藥的研發提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮房采自洪湖藍田種植區，品種名稱為“武植2號”，夏季6—8月份采收。將蓮房去籽，采用本實驗室已經建立的提取工藝（中華人民共和國專利（ZL02 1 15423. 6））進行提取，得到淺棕色粉末蓮房原花青素粗提物，后用乙酸乙酯萃取3 次，冷凍干燥制得LSOPC。LSOPC經鹽酸正丁醇法[17]檢測，其原花青素含量相對于葡萄籽原花青素標品為（106.22±0.46）%；通過液相色譜-質譜聯用分析，LSOPC的聚合度為3.2，在末端單元中兒茶素和表兒茶素分別占74.2%的和25.8%；而26.0%的兒茶素、43.1%的表兒茶素、30.9%的表沒食子兒茶素分別處在擴展單元。

葡萄籽原花青素標品（分析純） 上海源葉生物科技有限公司；牛血清白蛋白、葡萄糖、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純） 中國醫藥集團總公司；疊氮鈉（分析純） 天津市福晨化學試劑廠；氨基胍鹽酸鹽、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（均為分析純） 美國Sigma-Aldrich公司；標準金屬離子（分析純） 國家鋼鐵材料測試中心；AB-8大孔樹脂 天津南開合成科學技術公司。

1.2 儀器與設備

RE-111旋轉蒸發儀 瑞士Büchi公司；Analytic AC 210 S分析天平 德國Sartorius公司；電熱恒溫水浴鍋北京長安科學儀器廠；真空冷凍干燥機 德國Christ公司；KQ-50B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；FE20型pH計 瑞士Mettler-Toledo公司；WH-3型微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 AGEs體外孵育時間的確定

采用Brownlee的方法[18]，進行適當修改。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、葡萄糖（glucose，Glu）、疊氮鈉（sodium azide，NaN3）（防腐劑）和LSOPC分別用pH值為7.4的0.2 mol/L磷酸緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）溶解，加入30 mL的具塞玻璃管中，使其最終含量為BSA 5 mg/mL、Glu 36 mg/mL、NaN33 mmol/L、LSOPC 0.2 mg/mL。實驗分3組：1）對照組：BSA+Glu+NaN3；2）BSA組：BSA+NaN3；3）LSOPC組：BSA+Glu+LSOPC+NaN3，每組3 個平行，體系最終體積為30 mL（PBS補齊）。并于37 ℃的隔水式培養箱中密封避光孵育，后于3、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70 d取1 mL反應液進行檢測。

取獲得的1 mL反應液，避光冷卻至室溫，用pH值為7.4的PBS稀釋到4 mL，再用熒光分光光度計檢測其熒光值（λEX=370 nm，λEM=440 nm，入射和出射狹縫寬度皆為5 nm）。其熒光值都按稀釋倍數換算到原始濃度的熒光值，抑制率按式（1）[19]計算：

式中：IR為抑制率/%；F對照為對照組熒光值；FLSOPC為LSOPC組熒光值；FBSA為BSA組熒光值。

1.3.2 金屬離子對LSOPC在體外抑制AGEs生成的影響

用pH 6.5（為增加金屬離子溶解度）的0.2 mol/L PBS配制所需的反應溶液：BSA 5 mg/mL；Glu 36 mg/mL；NaN33 mmol/L；LSOPC（最終質量濃度為0.5 mg/mL）；金屬離子（Cu2+、Fe2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Sn2+，最終質量濃度為50、10、1、0.1 mg/L）。

按以下各組要求，取所需的反應液分別加入到5 mL的離心管中。實驗分5組：1）對照組：BSA+Glu+NaN3；2）BSA組：BSA+NaN3；3）LSOPC組：BSA+Glu+LSOPC+NaN3；4）金屬離子組：BSA+Glu+金屬離子+NaN3；5）金屬離子+LSOPC組：BSA+Glu+金屬離子+LSOPC+NaN3，每組3 個平行，體系最終體積為1 mL（PBS補齊），后于37 ℃的隔水式培養箱中密封避光孵育35 d。孵育后的反應液按1.3.1節方法進行熒光檢并計算抑制率。

1.3.3 高糖和高蛋白條件下LSOPC對體外AGEs生成的抑制

用pH 7.4的0.2 mol/L的PBS配制所需的溶液，實驗分4 組：1）高糖高蛋白組：BSA質量濃度100 mg/mL；Glu質量濃度576 mg/mL；2）高糖組：BSA質量濃度10 mg/mL；Glu質量濃度576 mg/mL；3）高蛋白組：BSA質量濃度100 mg/mL；Glu質量濃度144 mg/mL；4）正常組：BSA質量濃度10 mg/mL；Glu質量濃度144 mg/mL。陽性對照質量濃度為1 mg/mL，NaN3（防腐劑）濃度3 mmol/L。每組3 個平行，體系最終體積為1 mL（PBS補齊）。后于37 ℃的隔水式培養箱中密封避光孵育35 d。孵育后的反應液按1.3.1節方法進行熒光檢測并計算抑制率。

1.3.4 LSOPC與EGCG復配物對體外AGEs生成的抑制

1.3.4.1 LSOPC和EGCG對體外AGEs生成的抑制

按1.3.1節的方法將LSOPC和EGCG單獨進行體外抑制AGEs生成的實驗，并計算IC50值。

1.3.4.2 固定比例法評價LSOPC與EGCG的相互作用

在已知單個抗氧化劑IC50值和和兩個抗氧化劑IC50值比值的基礎上，將LSOPC和EGCG按幾組固定比例混合進行復配實驗。以兩種抗氧化劑IC50的比值作為參考，選擇的固定比例應包括兩種抗氧化劑效強含量相當及兩種抗氧化劑分別占主導地位的情況，即至少包含3 組固定比例[20]。從前面的LSOPC和EGCG體外抑制AGEs生成的實驗中可以得到，LSOPC與EGCG的IC50值比為1∶1.5。本實驗選擇3 組固定比例（質量濃度比），LSOPC與EGCG的固定比例定為6∶3、2∶3、2∶9，每組固定比例中的質量濃度對AGEs的抑制率選擇應在10%～100%范圍內均勻分布為宜。按固定比例混合后，以同樣的方法測定復合抗氧化劑對AGEs的抑制作用，計算清除率及復合組的IC50值。

1.4 統計學分析

利用等高線分析法研究LSOPC與EGCG之間的相互作用，為確定兩種抗氧化劑之間的作用類型（協同、拮抗、相加），需計算復合組的理論IC50,add值，公式如下：

式中：R為A、B兩種抗氧化劑單獨應用時的效價比，即R=IC50,A/IC50,B；P1為抗氧化劑A在復合組中所占的比例；P2為抗氧化劑B在復合組中所占的比例。相互作用指數（γ）值常用來評價協同或拮抗作用的程度，公式如下：

式中：γ為相互作用指數；IC50,Amix、IC50,Bmix為分別為復合組中A、B兩種抗氧化劑的IC50值；IC50,A、IC50,B分別為A、B兩種抗氧化劑單獨應用時的IC50值。若γ值為1，表示相互作用為相加；若γ值小于1，表示相互作用為協同作用。γ值越小說明協同作用越強；若γ值大于1，表示相互作用為拮抗作用[21]。

2 結果與分析

2.1 AGEs體外孵育時間的確定

圖1 不同時間條件下LSOPC對AGEs生成的抑制Fig.1 Inhibitory effects of LSOPC on AGEs formation at different incubation times

如圖1所示，對照組和L S O P C組的熒光值均隨著時間延長而增加，對照組的增加速度明顯快于L S O P C組，說明L S O P C對體外A G E s的生成能起到較好的抑制效果（B S A組的熒光值為（58.259±4.351）～（426.300±10.981），圖中未顯示）。由圖1可以看出，3～42 d，LSOPC對AGEs生成的抑制率不斷增加，28 d后趨于平穩，42 d后，由于LSOPC組熒光值急劇上升，其抑制率有一定程度的下降，故選35 d為最終的孵育時間。

2.2 不同質量濃度金屬離子對LSOPC在體外抑制AGEs生成的影響

圖2 不同質量濃度的金屬離子對AGEs生成的影響Fig.2 Effects of metal ions on AGEs formation

如圖2A所示，1～50 mg/L的Cu2+對AGEs的生成有較大的促進作用，0.1 mg/L的則無顯著性的影響。在1～50 mg/L中，其促進效果不隨質量濃度的增加而增加，在10 mg/L處出現最大值（-363.36±33.36）%。在Cu2++LSOPC組中，顯示Cu2+增加了LSOPC對AGEs的抑制率，其抑制率值隨著Cu2+質量濃度的增加而增加，從0～50 mg/L其抑制率分別為（79.82±2.47）%、（8 1.0 9±1.3 5）%、（9 6.6 0±0.0 3）%、（110.22±0.61）%、（116.67±0.31）%。說明Cu2+和LSOPC在抑制體外AGEs生成上存在一定的協同作用。

如圖2B所示，1～50 mg/L的Fe2+對AGEs的生成也有較大的促進作用，同樣0.1 mg/L的無顯著性影響。在1～50 mg/L中，其促進效果隨質量濃度的增加而增加，從1～50 mg/L其抑制率分別為（-34.93±6.82）%、（-134.22±8.38）%、（-164.16±20.19）%。在Fe2++LSOPC 組中，也顯示Fe2+增加了LSOPC對AGEs的抑制率，其抑制率值隨著Fe2+質量濃度的增加而增加，從0～50 mg/L其抑制率分別為（79.83±2.48）%、（8 0.3 0±0.5 1）%、（8 6.5 7±0.6 0）%、（112.02±0.43）%、（114.75±1.68）%。說明Fe2+和LSOPC在抑制體外AGEs生成上也存在一定的協同作用。

如圖2C所示，0.1 mg/L的Zn2+對AGEs的生成有一定的促進作用，其抑制率為（-16.82±1.47）%，50 mg/L的Zn2+對AGEs的生成有一定的抑制作用，其抑制率為（28.06±5.02）%，而其余2 個質量濃度則無顯著性的影響。在Zn2++LSOPC組中，顯示不同質量濃度的Zn2+對LSOPC抑制AGEs生成作用上均無顯著性影響。

如圖2D所示，1 mg/L的Mg2+對AGEs的生成有一定的促進作用，其抑制率為（12.11±4.27）%，10 mg/L和50 mg/L的Mg2+對AGEs的生成有一定的抑制作用，其抑制率分別為（-18.25±5.84）%和（-18.04±2.23）%，而0.1 mg/L的則無顯著性的影響。在Mg2++LSOPC組中，顯示0.1 mg/L Mg2+對LSOPC抑制AGEs生成作用上有略微的拮抗作用，其余質量濃度則無顯著性影響。

如圖2E所示，0.1～10 mg/L的Ca2+對AGEs的生成有一定的促進作用，50 mg/L的則無顯著性的影響。在0.1～10 mg/L中，其促進效果隨質量濃度的增加而降低，從0.1～10 mg/L其抑制率分別為（-27.08±6.29）%、（-22.71±2.06）%、（-19.63±6.15）%。在Ca2++LSOPC組中，顯示0.1 mg/L和1 mg/L的Ca2+對LSOPC抑制體外AGEs生成上存在一定的協同作用，而10 mg/L和50 mg/L的無顯著性影響，從0～50 mg/L其抑制率分別為（79.83±2.48）%、（86.70±0.80）%、（8 6.6 2±0.4 6）%、（8 0.3 2±0.4 6）%、（79.01±0.61）%。

如圖2F所示，0.1～10 mg/L的Al3+對AGEs的生成均有較大的抑制作用，并隨質量濃度的增大而增大，其抑制率分別為（29.74±6.11）%、（47.96±5.00）%、（72.56±2.35）%。且不同質量濃度的Al3+對LSOPC抑制AGEs生成作用上均無顯著性影響。

如圖2G所示，0.1～10 mg/L的Sn2+對AGEs的生成均有較大的抑制作用，并隨質量濃度的增大而增大，其抑制率分別為（34.29±8.42）%、（64.72±2.47）%、（81.77±10.28）%。且對LSOPC抑制AGEs生成作用上均無顯著性影響。

綜上結果顯示，不同質量濃度的不同金屬離子對體外AGEs生成的影響各不相同，其中Cu2+和Fe2+對模擬體系中催化AGEs生成作用最強，并且和LSOPC一起有協同抑制作用；其他5 種金屬離子對AGEs生成都有不同程度的抑制或促進作用，但對LSOPC幾乎無影響。由于在生理環境下游離金屬離子的質量濃度較為穩定且較低，故金屬離子對于體內AGEs生成的抑制作用有待進一步深入研究。

2.3 高糖高蛋白條件下LSOPC對體外AGEs生成的抑制

圖3 高糖和高蛋白質量濃度下LSOPC對體外AGEs生成的抑制Fig.3 Effects of LSOPC on AGEs formation at high concentrations of sugar or BSA

如圖3所示，在高糖高蛋白情況下，LSOPC對AGEs抑制的IC50為（0.383±0.055）mg/mL；在高糖情況下，IC50為（0.131±0.060）mg/mL；在高蛋白情況下，IC50為（0.390±0.035）mg/mL；在正常情況下，IC50為（0.115±0.052）mg/mL。由此可見，LSOPC在正常情況下對AGEs的抑制效果最好；在高糖情況下次之；在高蛋白和高糖高蛋白情況下抑制效果最差。這是因為在高糖高蛋白以及高蛋白質質量濃度生成的AGEs的量大約為高糖質量濃度條件下生成的AGEs的量的3 倍。這與王雅娟等[22]研究結果一致，其對影響AGEs生成因素進行正交試驗，結果顯示：BSA質量濃度＞孵育時間＞Glu質量濃度。因此，大量的AGEs的生成導致LSOPC抑制效果變差。

2.4 固定比例法評價LSOPC與EGCG對體外抑制AGEs生成的相互作用

2.4.1 LSOPC和EGCG對體外AGEs生成的抑制

按1.3.1節的方法將LSOPC和EGCG單獨進行體外抑制AGEs生成實驗，得到LSOPC的IC50為（0.115±0.005）mg/mL；EGCG的IC50為（0.172±0.008）mg/mL。

2.4.2 LSOPC與EGCG復配后對AGEs抑制率的測定

LSOPC和EGCG的固定比例（質量濃度比）選定為2∶1、2∶3、2∶9，每個比例設置5 組合適質量濃度，測定AGEs抑制能力，計算抑制率和IC50值，結果見表1。

表 1 LSOPC與EGCG復配后抑制AGEs的能力Table1 Inhibitory effect on AGEs formation of LSOPC combined with EGCG

2.4.3 統計學分析

按1.4節所述方法計算復配組理論上的IC50,add值和γ值，對理論IC50,add值和實驗IC50,mix值在95%置信區間進行t檢驗，結果見表2 。

表 2 LSOPC與EGCG復配后的統計學分析結果Table2 Antioxidant interactions of LSOPC combined with EGCG

由表2可以看出，各種組合的IC50,mix值均小于IC50,add值，經過t檢驗證明兩者之間有顯著性差異，且γ值都小于1，表明LSOPC與EGCG的相互作用是協同作用。γ值越小說明協同作用越強，由此可得LSOPC與EGCG復配組中協同作用的強弱順序為2∶1＞2∶9＞2∶3。

3 討 論

研究證實，LSOPC是一種具有強抗氧化活性和多種生物學功能的酚類物質[23]。因其很好的清除自由基和螯合金屬離子抗脂質過氧化作性質，可能作為AGEs天然抑制劑。本實驗首先選取了在模擬生理環境下，最適反應時間為35 d，此時，LSOPC的抑制效果達到最大值并且最穩定。

當pH值接近中性時，Maillard反應是通過離子機理進行的，易受到各種離子的影響[24]。特別是多價態的過渡金屬離子能夠與Maillard反應產物形成復雜的化合物，氧化Amadori化合物及其衍生物并催化這些物質之間的進一步相互作用。弱堿性環境下，有利于Maillard反應產物的生成，在該條件會導致AGEs大量生成，在弱酸性環境下，AGEs生成相對減少[25]。先前關于金屬離子對AGEs產生的影響研究主要是在較高溫度下進行的[6]，而37 ℃ Maillard反應中金屬離子的催化作用研究鮮見報道[26]。因此本實驗研究37 ℃、pH 6.5條件下，Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Sn2+對葡萄糖-牛血清白蛋白反應體系中，AGEs生成的影響。其中Cu2+和Fe2+有較大的促進作用，這可能是Cu2+和Fe2+的催化作用所致。另一方面值得注意的是，Cu2+和Fe2+與LSOPC一起有協同抑制AGEs生成的作用，這可能是由于Cu2+和Fe2+與LSOPC形成了金屬配合物，配合物相較于LSOPC有更強的抗氧化活性；而Al3+和Sn2+則有一定的抑制作用，對LSOPC抑制AGEs的生成無顯著性影響；Zn2+在低質量濃度（0.1、1 mg/L）促進作用，高質量濃度（10、50 mg/L）抑制作用。Mg2+則與Zn2+相反，在低質量濃度抑制作用，高質量濃度促進作用。Ca2+對AGEs的生成有較少的促進作用，Zn2+、Mg2+和Ca2+三種金屬離子對LSOPC抑制AGEs的生成影響都不大。

由于Maillard反應非常復雜，目前關于金屬離子在Maillard反應的各個階段的作用機理尚不完全清楚。過渡金屬離子對糖基化反應的催化作用主要是通過氧化路徑[27]，促進Schiff堿形成Amadori產物[28-29]，同時又催化Amadori產物自動氧化[24]，即催化初級Maillard反應。此外，葡萄糖在過渡金屬離子（如Cu2+）的作用下氧化形成活性二羰基化合物以及活性氧自由基[6]，進而促進反應。隨著加入Maillard反應體系中的金屬離子的質量濃度的增大會使反應體系中出現自由金屬離子，在一定質量濃度下它的存在可以通過氧化/還原效應促進Maillard反應，也可能因引起副反應進而抑制Maillard反應；同時，Maillard反應體系中金屬離子和Maillard反應產物形成復雜的復合物，在反應一定時間后該復合物通過自身或和其他反應產物之間的進一步反應可能使復合物中的金屬離子以活性更強的自由金屬離子的形式被重新釋放出來，進而催化Maillard反應[24]。因而，金屬離子對于AGEs生成的影響不僅和反應物類型、反應溫度、反應時間以及反應介質等有關，而且和金屬離子本身有關。

Baynes等[30]認為氧化應激能促進并加速體內AGEs的形成，而在John等[31]研究氧氣對Maillard反應影響的實驗中，其結果顯示雖然無氧條件能較好地抑制Maillard反應前期中間產物乙二醛和甲基乙二醛的產生，但對后期的反應卻并無抑制作用，此外其研究還表示在抗氧化條件下雖能抑制葡萄糖Maillard反應的發生但無法有效地抑制戊糖Maillard反應的發生。還有研究表明[32]，在Maillard反應后期會生成具有抗氧化性和消自由基能力的還原酮化合物。故可以推測抗氧化劑對Maillard反應的前期進程應該有較好的抑制作用。目前，對于AGEs抑制劑體內體外篩選實驗仍集中在單一的天然抗氧化劑對于模擬生理環境或食品體系加工中對于AGEs生成的影響。本實驗對于LSOPC與EGCG復配得到了比單一LSOPC更好地清除DPPH自由基的作用，提示復配可以提高LSOPC的抗氧化性。因此，本實驗選取LSOPC與EGCG復配，發現LSOPC與EGCG在質量濃度比為2∶1、2∶9和2∶3時，都具有協同抑制效果，且2∶1時抑制效果最好。研究結果旨在為開發高效復配型天然AGEs抑制劑提供新思路。

4 結 論

本實驗探究了LSOPC對于模擬生理體系中AGEs的抑制情況，不同質量濃度的LSOPC在37 ℃與BSA和葡萄糖避光密封孵育35 d，其IC50為0.039 mg/mL（95%置信區間為0.035～0.043 mg/mL）。不同質量濃度的不同金屬離子對體外AGEs生成的影響各不相同，其中Cu2+和Fe2+對模擬體系中催化AGEs生成作用最強，并且和LSOPC一起有協同抑制作用；其他5 種金屬離子對AGEs生成都有不同程度的抑制或促進作用，但對LSOPC幾乎無影響。在高糖高蛋白反應體系中，發現LSOPC在高糖高蛋白以及高蛋白情況下，抑制效果最差。發現LSOPC與EGCG復配有協同抑制AGEs效果，并且在LSOPC于EGCG質量濃度比為2∶1時最佳。

[1] AMES J M. Applications of the Maillard reaction in the food industry[J]. Food Chemistry, 1998, 62(4): 431-439. DOI:10.1016/S0308-8146(98)00078-8.

[2] GOLDIN A, BECKMAN J A, SCHMIDT A M, et al. Advanced glycation end products sparking the development of diabetic vascular injury[J]. Circulation, 2006, 114(6): 597-605. DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.106.621854.

[3] 周娟, 張悅, 陸海英, 等. 晚期糖基化終產物在糖尿病腎病中的病理作用[J]. 生理科學進展, 2009, 40(4)∶ 372-375.

[4] PEPPA M, BREM H, CAI W, et al. Prevention and reversal of diabetic nephropathy in db/db mice treated with alagebrium (ALT-711)[J]. American Journal of Nephrology, 2006, 26(5): 430-436.DOI:10.1159/000095786.

[5] LIEUW-A-FA M, SCHALKWIJK C, ENGELSE M, et al. Interaction of N?(carboxymethyl)lysine and methylglyoxal-modif i ed albumin with endothelial cells and macrophages. Splice variants of RAGE may 1imit the responsiveness of human endothelial cells to AGEs[J]. Thromb Haemost, 2006, 95(2): 320-328. DOI:10.1160/TH05-04-0248.

[6] RAMONAITYTE D T, KER?IENE M, ADAMS A, et al. The interaction of metal ions with Maillard reaction products in a lactoseglycine model system[J]. Food Research International, 2009, 42(3):331-336. DOI:10.1016/j.foodres.2008.12.008.

[7] 吳惠玲, 王志強, 韓春. 影響美拉德反應的幾種因素研究[J].現代食品科技, 2010, 26(5)∶ 441-444. DOI∶10.13982/j.mfst.1673-9078.2010.05.019.

[8] 毛雪石. 黃酮類化合物的抗腫瘤活性[J]. 國外醫學∶ 藥學分冊, 1995,22(2)∶ 92-96. DOI∶10.13220/j.cnki.jipr.1995.02.008.

[9] KISCH E, JAFFE A, KNOLL E. Role of the lipoxygenase pathway in angiotensin II-induced vasoconstriction in the human placenta[J].Hypertension, 1997, 29(3)∶ 796-801. DOI∶10.1161/01.HYP.29.3.796.

[10] PASHIKANTI S, DE ALBA D R, BOISSONNEAULT G A, et al.Rutin metabolites∶ novel inhibitors of nonoxidative advanced glycation end products[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2010, 48(5)∶ 656-663. DOI∶10.1016/j.freeradbiomed.2009.11.019.

[11] LAUREAND C, SCHRAMM D, JACOBSON E L, et al. Inhibition of advanced glycation end product formation on collagen by rutin and its metabolites[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 2006, 17(8)∶531-540. DOI∶10.1016/j.jnutbio.2005.10.002.

[12] 凌智群. 蓮房原花青素及其生物藥理活性研究[D]. 武漢∶ 華中農業大學, 2008.

[13] 禹華娟. 蓮原花青素的酶輔助提取技術及其在油脂中的抗氧化活性研究[D]. 武漢∶ 華中農業大學, 2010.

[14] WANG W, YAVUZ Y, BURAN T, et al. Phytochemicals from berries and grapes inhibited the formation of advanced glycation end-products by scavenging reactive carbonyls[J]. Food Research International,2011, 44(9): 2666-2673. DOI:10.1016/j.foodres.2011.05.022.

[15] PENG X F, CHENG K W, MA J, et al. Cinnamon bark proanthocyanidins as reactive carbonyl scavengers to prevent the formation of advanced glycation endproducts[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(6)∶ 1907-1911.DOI∶10.1021/jf073065v.

[16] WU Q, LI S Y, LI X P, et al. A signif i cant inhibitory effect on advanced glycation end product formation by catechin as the major metabolite of lotus seedpod oligomeric procyanidins[J]. Nutrients, 2014, 6(8)∶ 3230-3244. DOI∶10.3390/nu6083230.

[17] PORTER L J, HRSTICH L N, CHAN B G. The conversion of procyanidins and prodelphinidins to cyanidin and delphinidin[J].Phytochemistry, 1985, 25(1)∶ 223-230. DOI∶10.1016/S0031-9422(00)94533-3.

[18] BROWNLEE M, VLASSARA H, KOONEY A, et al. Aminoguanidine prevents diabetes-induced arterial wall protein cross-linkin[J]. Science,1986, 232∶ 1629-1632. DOI∶10.1126/science.3487117.

[19] 許良元, 劉勇, 張弓, 等. 晚期糖基化終末產物熒光測量及其預校正技術研究[J]. 光譜學與光譜分析, 2010(1)∶ 230-232.

[20] PETER K G. Isobolographic analysis of interactions∶an update on applications and utility[J]. Toxicology, 1995, 105(2)∶ 161-179.DOI∶10.1016/0300-483X(95)03210-7.

[21] RONALD J T. The interaction index∶ a measure of drug synergism[J].Pain, 2002, 98(1)∶ 163-168. DOI∶10.1016/S0304-3959(02)00041-6.

[22] 王雅娟, 錢之玉, 沈祥春. 西紅花酸對體外蛋白質非酶糖基化的抑制作用[J]. 中草藥, 2005, 36(8)∶ 1202-1205.

[23] 凌智群, 謝筆鈞, 江濤, 等. 蓮房原花青素對大鼠實驗性心肌缺血的保護作用[J]. 中國藥理學通報, 2001, 17(6)∶ 687-690.

[24] RIZZI G P. Effects of cationic species on visual color formation in model Maillard reactions of pentose sugar and amino acids[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(16)∶ 7160-7164.DOI∶10.1021/jf801197n.

[25] YU A N, TAN Z W, SHI B A. Inf l uence of the pH on the formation of pyrazine compounds by the Maillard reaction of L-ascorbic acid with acidic, basic and neutral amino acids[J]. Asia-Pacif i c Journal Chemical Engineering, 2012, 7(3)∶ 455-462. DOI∶10.1002/apj.594.

[26] SAJITHLAL G B, CHITHRA P, CHANDRAKASAN G. The role of metal-catalyzed oxidation in the formation of advanced glycation end products∶ an in vitro study on collagen[J]. Free Radical Biology and Medicine, 1998, 25(3)∶ 265-269. DOI∶10.1016/S0891-5849(98)00035-5.

[27] BOOTH A A, KHALIFAH R G, TODD P, et al. In vitro kinetic studies of formation of antigenic advanced glycation end products (AGEs)novel inhibition of post-Amadori glycation pathways[J]. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(9)∶ 5430-5437. DOI:10.1074/jbc.272.9.5430.

[28] MORITA J, KASHIMURA N. The Maillard reaction of DNA with D-fructose 6-phosphate[J]. Agricultural and Biological Chemistry,1991, 50(5): 1359-1366. DOI:10.1080/00021369.1991.10870762.

[29] HAYASE F, SHIBUYA T, SATO J, et al. Effects of oxygen and transition metals on the advanced maillard reaction of proteins with glucose[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1996, 60(11):1820-1825. DOI:10.1271/bbb.60.1820.

[30] BAYNES J, THORPE S. Role of oxidative stress in diabetic complications: a new perspective on an old paradigm[J]. Diabetes,1999, 48(1): 1-9. DOI:10.2337/diabetes.48.1.1.

[31] JOHN E L, SUZANNE R T, JOHN W B. Oxygen is not required for the browning and crosslinking of protein by pentoses: relevance to Maillard reactions in vivo[J]. The International Journal of Biochemistry &Cell Biology, 1999, 31(11): 1297-1305. DOI:10.1016/S1357-2725(99)00091-6.

[32] 石階平, 霍軍生. 食品化學[M]. 北京∶ 中國農業大學出版社, 2008∶212-223.