蓮原花青素低聚體在模擬生理環(huán)境下對非酶糖化末端產(chǎn)物的抑制作用

閔瑤瑤，周夢舟，柳志杰，馮年捷*，吳 茜,*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430068；2.湖北工業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院，湖北 武漢 430068）

非酶糖化反應(yīng)，又稱Maillard反應(yīng)[1]，該反應(yīng)使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)而失去活性，生成不可逆的非酶糖化末端產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）。AGEs在體內(nèi)大量積累可導(dǎo)致糖尿病[2]、腎病（尿毒癥）[3]、動脈粥樣硬化[4]、衰老和阿茨海默爾[5]等疾病的發(fā)生。研究表明[6]，大部分過渡金屬離子（Fe3+、Fe2+、Cu2+、Zn2+）都能有效地促進(jìn)非酶糖化反應(yīng)的進(jìn)行，而Cu2+和Zn2+只在低質(zhì)量濃度（1～5 mg/L）下有促進(jìn)作用，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到5～25 mg/L時，反而對非酶糖化反應(yīng)有一定的抑制作用，此外部分非過渡金屬如Ca2+和Mg2+則會對反應(yīng)有一定的抑制作用[7]。黃酮類化合物是一類重要的天然產(chǎn)物，其母核為2-苯基色原酮，具有清除自由基、抗癌以及防治心血管疾病等功效[8-9]。研究表明，蘆丁、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）等黃酮類化合物對于生理條件下非酶糖化反應(yīng)有較強(qiáng)的抑制作用[10-11]。

從蓮科植物蓮的成熟花托即蓮房中提取的蓮原花青素（oligomeric procyanidins of lotus seedpod，LSOPC），用乙醇提取并用乙酸乙酯萃取的LSOPC的主要成分為兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素及其二、三、四聚體，其單體以兒茶素為主[12]。無論在體內(nèi)外，LSOPC均有很好的抗氧化、螯合金屬離子及消除自由基的功能[13-14]，并有研究顯示原花青素能在體外清除Maillard反應(yīng)的中間產(chǎn)物——活性羰基[15-16]。故LSOPC可能是一種較好的體內(nèi)外AGEs抑制劑，本實驗從模擬生理環(huán)境驗證LSOPC對AGEs的抑制效果，并尋找更有效的AGEs復(fù)配抑制劑，以此為體內(nèi)的AGEs生成抑制及相關(guān)慢性疾病的外源膳食補(bǔ)充劑或新藥的研發(fā)提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮房采自洪湖藍(lán)田種植區(qū)，品種名稱為“武植2號”，夏季6—8月份采收。將蓮房去籽，采用本實驗室已經(jīng)建立的提取工藝（中華人民共和國專利（ZL02 1 15423. 6））進(jìn)行提取，得到淺棕色粉末蓮房原花青素粗提物，后用乙酸乙酯萃取3 次，冷凍干燥制得LSOPC。LSOPC經(jīng)鹽酸正丁醇法[17]檢測，其原花青素含量相對于葡萄籽原花青素標(biāo)品為（106.22±0.46）%；通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，LSOPC的聚合度為3.2，在末端單元中兒茶素和表兒茶素分別占74.2%的和25.8%；而26.0%的兒茶素、43.1%的表兒茶素、30.9%的表沒食子兒茶素分別處在擴(kuò)展單元。

葡萄籽原花青素標(biāo)品（分析純） 上海源葉生物科技有限公司；牛血清白蛋白、葡萄糖、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純） 中國醫(yī)藥集團(tuán)總公司；疊氮鈉（分析純） 天津市福晨化學(xué)試劑廠；氨基胍鹽酸鹽、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（均為分析純） 美國Sigma-Aldrich公司；標(biāo)準(zhǔn)金屬離子（分析純） 國家鋼鐵材料測試中心；AB-8大孔樹脂 天津南開合成科學(xué)技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-111旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；Analytic AC 210 S分析天平 德國Sartorius公司；電熱恒溫水浴鍋北京長安科學(xué)儀器廠；真空冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；KQ-50B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；FE20型pH計 瑞士Mettler-Toledo公司；WH-3型微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 AGEs體外孵育時間的確定

采用Brownlee的方法[18]，進(jìn)行適當(dāng)修改。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、葡萄糖（glucose，Glu）、疊氮鈉（sodium azide，NaN3）（防腐劑）和LSOPC分別用pH值為7.4的0.2 mol/L磷酸緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）溶解，加入30 mL的具塞玻璃管中，使其最終含量為BSA 5 mg/mL、Glu 36 mg/mL、NaN33 mmol/L、LSOPC 0.2 mg/mL。實驗分3組：1）對照組：BSA+Glu+NaN3；2）BSA組：BSA+NaN3；3）LSOPC組：BSA+Glu+LSOPC+NaN3，每組3 個平行，體系最終體積為30 mL（PBS補(bǔ)齊）。并于37 ℃的隔水式培養(yǎng)箱中密封避光孵育，后于3、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70 d取1 mL反應(yīng)液進(jìn)行檢測。

取獲得的1 mL反應(yīng)液，避光冷卻至室溫，用pH值為7.4的PBS稀釋到4 mL，再用熒光分光光度計檢測其熒光值（λEX=370 nm，λEM=440 nm，入射和出射狹縫寬度皆為5 nm）。其熒光值都按稀釋倍數(shù)換算到原始濃度的熒光值，抑制率按式（1）[19]計算：

式中：IR為抑制率/%；F對照為對照組熒光值；FLSOPC為LSOPC組熒光值；FBSA為BSA組熒光值。

1.3.2 金屬離子對LSOPC在體外抑制AGEs生成的影響

用pH 6.5（為增加金屬離子溶解度）的0.2 mol/L PBS配制所需的反應(yīng)溶液：BSA 5 mg/mL；Glu 36 mg/mL；NaN33 mmol/L；LSOPC（最終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL）；金屬離子（Cu2+、Fe2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Sn2+，最終質(zhì)量濃度為50、10、1、0.1 mg/L）。

按以下各組要求，取所需的反應(yīng)液分別加入到5 mL的離心管中。實驗分5組：1）對照組：BSA+Glu+NaN3；2）BSA組：BSA+NaN3；3）LSOPC組：BSA+Glu+LSOPC+NaN3；4）金屬離子組：BSA+Glu+金屬離子+NaN3；5）金屬離子+LSOPC組：BSA+Glu+金屬離子+LSOPC+NaN3，每組3 個平行，體系最終體積為1 mL（PBS補(bǔ)齊），后于37 ℃的隔水式培養(yǎng)箱中密封避光孵育35 d。孵育后的反應(yīng)液按1.3.1節(jié)方法進(jìn)行熒光檢并計算抑制率。

1.3.3 高糖和高蛋白條件下LSOPC對體外AGEs生成的抑制

用pH 7.4的0.2 mol/L的PBS配制所需的溶液，實驗分4 組：1）高糖高蛋白組：BSA質(zhì)量濃度100 mg/mL；Glu質(zhì)量濃度576 mg/mL；2）高糖組：BSA質(zhì)量濃度10 mg/mL；Glu質(zhì)量濃度576 mg/mL；3）高蛋白組：BSA質(zhì)量濃度100 mg/mL；Glu質(zhì)量濃度144 mg/mL；4）正常組：BSA質(zhì)量濃度10 mg/mL；Glu質(zhì)量濃度144 mg/mL。陽性對照質(zhì)量濃度為1 mg/mL，NaN3（防腐劑）濃度3 mmol/L。每組3 個平行，體系最終體積為1 mL（PBS補(bǔ)齊）。后于37 ℃的隔水式培養(yǎng)箱中密封避光孵育35 d。孵育后的反應(yīng)液按1.3.1節(jié)方法進(jìn)行熒光檢測并計算抑制率。

1.3.4 LSOPC與EGCG復(fù)配物對體外AGEs生成的抑制

1.3.4.1 LSOPC和EGCG對體外AGEs生成的抑制

按1.3.1節(jié)的方法將LSOPC和EGCG單獨進(jìn)行體外抑制AGEs生成的實驗，并計算IC50值。

1.3.4.2 固定比例法評價LSOPC與EGCG的相互作用

在已知單個抗氧化劑IC50值和和兩個抗氧化劑IC50值比值的基礎(chǔ)上，將LSOPC和EGCG按幾組固定比例混合進(jìn)行復(fù)配實驗。以兩種抗氧化劑IC50的比值作為參考，選擇的固定比例應(yīng)包括兩種抗氧化劑效強(qiáng)含量相當(dāng)及兩種抗氧化劑分別占主導(dǎo)地位的情況，即至少包含3 組固定比例[20]。從前面的LSOPC和EGCG體外抑制AGEs生成的實驗中可以得到，LSOPC與EGCG的IC50值比為1∶1.5。本實驗選擇3 組固定比例（質(zhì)量濃度比），LSOPC與EGCG的固定比例定為6∶3、2∶3、2∶9，每組固定比例中的質(zhì)量濃度對AGEs的抑制率選擇應(yīng)在10%～100%范圍內(nèi)均勻分布為宜。按固定比例混合后，以同樣的方法測定復(fù)合抗氧化劑對AGEs的抑制作用，計算清除率及復(fù)合組的IC50值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

利用等高線分析法研究LSOPC與EGCG之間的相互作用，為確定兩種抗氧化劑之間的作用類型（協(xié)同、拮抗、相加），需計算復(fù)合組的理論IC50,add值，公式如下：

式中：R為A、B兩種抗氧化劑單獨應(yīng)用時的效價比，即R=IC50,A/IC50,B；P1為抗氧化劑A在復(fù)合組中所占的比例；P2為抗氧化劑B在復(fù)合組中所占的比例。相互作用指數(shù)（γ）值常用來評價協(xié)同或拮抗作用的程度，公式如下：

式中：γ為相互作用指數(shù)；IC50,Amix、IC50,Bmix為分別為復(fù)合組中A、B兩種抗氧化劑的IC50值；IC50,A、IC50,B分別為A、B兩種抗氧化劑單獨應(yīng)用時的IC50值。若γ值為1，表示相互作用為相加；若γ值小于1，表示相互作用為協(xié)同作用。γ值越小說明協(xié)同作用越強(qiáng)；若γ值大于1，表示相互作用為拮抗作用[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 AGEs體外孵育時間的確定

圖1 不同時間條件下LSOPC對AGEs生成的抑制Fig.1 Inhibitory effects of LSOPC on AGEs formation at different incubation times

如圖1所示，對照組和L S O P C組的熒光值均隨著時間延長而增加，對照組的增加速度明顯快于L S O P C組，說明L S O P C對體外A G E s的生成能起到較好的抑制效果（B S A組的熒光值為（58.259±4.351）～（426.300±10.981），圖中未顯示）。由圖1可以看出，3～42 d，LSOPC對AGEs生成的抑制率不斷增加，28 d后趨于平穩(wěn)，42 d后，由于LSOPC組熒光值急劇上升，其抑制率有一定程度的下降，故選35 d為最終的孵育時間。

2.2 不同質(zhì)量濃度金屬離子對LSOPC在體外抑制AGEs生成的影響

圖2 不同質(zhì)量濃度的金屬離子對AGEs生成的影響Fig.2 Effects of metal ions on AGEs formation

如圖2A所示，1～50 mg/L的Cu2+對AGEs的生成有較大的促進(jìn)作用，0.1 mg/L的則無顯著性的影響。在1～50 mg/L中，其促進(jìn)效果不隨質(zhì)量濃度的增加而增加，在10 mg/L處出現(xiàn)最大值（-363.36±33.36）%。在Cu2++LSOPC組中，顯示Cu2+增加了LSOPC對AGEs的抑制率，其抑制率值隨著Cu2+質(zhì)量濃度的增加而增加，從0～50 mg/L其抑制率分別為（79.82±2.47）%、（8 1.0 9±1.3 5）%、（9 6.6 0±0.0 3）%、（110.22±0.61）%、（116.67±0.31）%。說明Cu2+和LSOPC在抑制體外AGEs生成上存在一定的協(xié)同作用。

如圖2B所示，1～50 mg/L的Fe2+對AGEs的生成也有較大的促進(jìn)作用，同樣0.1 mg/L的無顯著性影響。在1～50 mg/L中，其促進(jìn)效果隨質(zhì)量濃度的增加而增加，從1～50 mg/L其抑制率分別為（-34.93±6.82）%、（-134.22±8.38）%、（-164.16±20.19）%。在Fe2++LSOPC 組中，也顯示Fe2+增加了LSOPC對AGEs的抑制率，其抑制率值隨著Fe2+質(zhì)量濃度的增加而增加，從0～50 mg/L其抑制率分別為（79.83±2.48）%、（8 0.3 0±0.5 1）%、（8 6.5 7±0.6 0）%、（112.02±0.43）%、（114.75±1.68）%。說明Fe2+和LSOPC在抑制體外AGEs生成上也存在一定的協(xié)同作用。

如圖2C所示，0.1 mg/L的Zn2+對AGEs的生成有一定的促進(jìn)作用，其抑制率為（-16.82±1.47）%，50 mg/L的Zn2+對AGEs的生成有一定的抑制作用，其抑制率為（28.06±5.02）%，而其余2 個質(zhì)量濃度則無顯著性的影響。在Zn2++LSOPC組中，顯示不同質(zhì)量濃度的Zn2+對LSOPC抑制AGEs生成作用上均無顯著性影響。

如圖2D所示，1 mg/L的Mg2+對AGEs的生成有一定的促進(jìn)作用，其抑制率為（12.11±4.27）%，10 mg/L和50 mg/L的Mg2+對AGEs的生成有一定的抑制作用，其抑制率分別為（-18.25±5.84）%和（-18.04±2.23）%，而0.1 mg/L的則無顯著性的影響。在Mg2++LSOPC組中，顯示0.1 mg/L Mg2+對LSOPC抑制AGEs生成作用上有略微的拮抗作用，其余質(zhì)量濃度則無顯著性影響。

如圖2E所示，0.1～10 mg/L的Ca2+對AGEs的生成有一定的促進(jìn)作用，50 mg/L的則無顯著性的影響。在0.1～10 mg/L中，其促進(jìn)效果隨質(zhì)量濃度的增加而降低，從0.1～10 mg/L其抑制率分別為（-27.08±6.29）%、（-22.71±2.06）%、（-19.63±6.15）%。在Ca2++LSOPC組中，顯示0.1 mg/L和1 mg/L的Ca2+對LSOPC抑制體外AGEs生成上存在一定的協(xié)同作用，而10 mg/L和50 mg/L的無顯著性影響，從0～50 mg/L其抑制率分別為（79.83±2.48）%、（86.70±0.80）%、（8 6.6 2±0.4 6）%、（8 0.3 2±0.4 6）%、（79.01±0.61）%。

如圖2F所示，0.1～10 mg/L的Al3+對AGEs的生成均有較大的抑制作用，并隨質(zhì)量濃度的增大而增大，其抑制率分別為（29.74±6.11）%、（47.96±5.00）%、（72.56±2.35）%。且不同質(zhì)量濃度的Al3+對LSOPC抑制AGEs生成作用上均無顯著性影響。

如圖2G所示，0.1～10 mg/L的Sn2+對AGEs的生成均有較大的抑制作用，并隨質(zhì)量濃度的增大而增大，其抑制率分別為（34.29±8.42）%、（64.72±2.47）%、（81.77±10.28）%。且對LSOPC抑制AGEs生成作用上均無顯著性影響。

綜上結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度的不同金屬離子對體外AGEs生成的影響各不相同，其中Cu2+和Fe2+對模擬體系中催化AGEs生成作用最強(qiáng)，并且和LSOPC一起有協(xié)同抑制作用；其他5 種金屬離子對AGEs生成都有不同程度的抑制或促進(jìn)作用，但對LSOPC幾乎無影響。由于在生理環(huán)境下游離金屬離子的質(zhì)量濃度較為穩(wěn)定且較低，故金屬離子對于體內(nèi)AGEs生成的抑制作用有待進(jìn)一步深入研究。

2.3 高糖高蛋白條件下LSOPC對體外AGEs生成的抑制

圖3 高糖和高蛋白質(zhì)量濃度下LSOPC對體外AGEs生成的抑制Fig.3 Effects of LSOPC on AGEs formation at high concentrations of sugar or BSA

如圖3所示，在高糖高蛋白情況下，LSOPC對AGEs抑制的IC50為（0.383±0.055）mg/mL；在高糖情況下，IC50為（0.131±0.060）mg/mL；在高蛋白情況下，IC50為（0.390±0.035）mg/mL；在正常情況下，IC50為（0.115±0.052）mg/mL。由此可見，LSOPC在正常情況下對AGEs的抑制效果最好；在高糖情況下次之；在高蛋白和高糖高蛋白情況下抑制效果最差。這是因為在高糖高蛋白以及高蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度生成的AGEs的量大約為高糖質(zhì)量濃度條件下生成的AGEs的量的3 倍。這與王雅娟等[22]研究結(jié)果一致，其對影響AGEs生成因素進(jìn)行正交試驗，結(jié)果顯示：BSA質(zhì)量濃度＞孵育時間＞Glu質(zhì)量濃度。因此，大量的AGEs的生成導(dǎo)致LSOPC抑制效果變差。

2.4 固定比例法評價LSOPC與EGCG對體外抑制AGEs生成的相互作用

2.4.1 LSOPC和EGCG對體外AGEs生成的抑制

按1.3.1節(jié)的方法將LSOPC和EGCG單獨進(jìn)行體外抑制AGEs生成實驗，得到LSOPC的IC50為（0.115±0.005）mg/mL；EGCG的IC50為（0.172±0.008）mg/mL。

2.4.2 LSOPC與EGCG復(fù)配后對AGEs抑制率的測定

LSOPC和EGCG的固定比例（質(zhì)量濃度比）選定為2∶1、2∶3、2∶9，每個比例設(shè)置5 組合適質(zhì)量濃度，測定AGEs抑制能力，計算抑制率和IC50值，結(jié)果見表1。

表 1 LSOPC與EGCG復(fù)配后抑制AGEs的能力Table1 Inhibitory effect on AGEs formation of LSOPC combined with EGCG

2.4.3 統(tǒng)計學(xué)分析

按1.4節(jié)所述方法計算復(fù)配組理論上的IC50,add值和γ值，對理論IC50,add值和實驗IC50,mix值在95%置信區(qū)間進(jìn)行t檢驗，結(jié)果見表2 。

表 2 LSOPC與EGCG復(fù)配后的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果Table2 Antioxidant interactions of LSOPC combined with EGCG

由表2可以看出，各種組合的IC50,mix值均小于IC50,add值，經(jīng)過t檢驗證明兩者之間有顯著性差異，且γ值都小于1，表明LSOPC與EGCG的相互作用是協(xié)同作用。γ值越小說明協(xié)同作用越強(qiáng)，由此可得LSOPC與EGCG復(fù)配組中協(xié)同作用的強(qiáng)弱順序為2∶1＞2∶9＞2∶3。

3 討 論

研究證實，LSOPC是一種具有強(qiáng)抗氧化活性和多種生物學(xué)功能的酚類物質(zhì)[23]。因其很好的清除自由基和螯合金屬離子抗脂質(zhì)過氧化作性質(zhì)，可能作為AGEs天然抑制劑。本實驗首先選取了在模擬生理環(huán)境下，最適反應(yīng)時間為35 d，此時，LSOPC的抑制效果達(dá)到最大值并且最穩(wěn)定。

當(dāng)pH值接近中性時，Maillard反應(yīng)是通過離子機(jī)理進(jìn)行的，易受到各種離子的影響[24]。特別是多價態(tài)的過渡金屬離子能夠與Maillard反應(yīng)產(chǎn)物形成復(fù)雜的化合物，氧化Amadori化合物及其衍生物并催化這些物質(zhì)之間的進(jìn)一步相互作用。弱堿性環(huán)境下，有利于Maillard反應(yīng)產(chǎn)物的生成，在該條件會導(dǎo)致AGEs大量生成，在弱酸性環(huán)境下，AGEs生成相對減少[25]。先前關(guān)于金屬離子對AGEs產(chǎn)生的影響研究主要是在較高溫度下進(jìn)行的[6]，而37 ℃ Maillard反應(yīng)中金屬離子的催化作用研究鮮見報道[26]。因此本實驗研究37 ℃、pH 6.5條件下，Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Sn2+對葡萄糖-牛血清白蛋白反應(yīng)體系中，AGEs生成的影響。其中Cu2+和Fe2+有較大的促進(jìn)作用，這可能是Cu2+和Fe2+的催化作用所致。另一方面值得注意的是，Cu2+和Fe2+與LSOPC一起有協(xié)同抑制AGEs生成的作用，這可能是由于Cu2+和Fe2+與LSOPC形成了金屬配合物，配合物相較于LSOPC有更強(qiáng)的抗氧化活性；而Al3+和Sn2+則有一定的抑制作用，對LSOPC抑制AGEs的生成無顯著性影響；Zn2+在低質(zhì)量濃度（0.1、1 mg/L）促進(jìn)作用，高質(zhì)量濃度（10、50 mg/L）抑制作用。Mg2+則與Zn2+相反，在低質(zhì)量濃度抑制作用，高質(zhì)量濃度促進(jìn)作用。Ca2+對AGEs的生成有較少的促進(jìn)作用，Zn2+、Mg2+和Ca2+三種金屬離子對LSOPC抑制AGEs的生成影響都不大。

由于Maillard反應(yīng)非常復(fù)雜，目前關(guān)于金屬離子在Maillard反應(yīng)的各個階段的作用機(jī)理尚不完全清楚。過渡金屬離子對糖基化反應(yīng)的催化作用主要是通過氧化路徑[27]，促進(jìn)Schiff堿形成Amadori產(chǎn)物[28-29]，同時又催化Amadori產(chǎn)物自動氧化[24]，即催化初級Maillard反應(yīng)。此外，葡萄糖在過渡金屬離子（如Cu2+）的作用下氧化形成活性二羰基化合物以及活性氧自由基[6]，進(jìn)而促進(jìn)反應(yīng)。隨著加入Maillard反應(yīng)體系中的金屬離子的質(zhì)量濃度的增大會使反應(yīng)體系中出現(xiàn)自由金屬離子，在一定質(zhì)量濃度下它的存在可以通過氧化/還原效應(yīng)促進(jìn)Maillard反應(yīng)，也可能因引起副反應(yīng)進(jìn)而抑制Maillard反應(yīng)；同時，Maillard反應(yīng)體系中金屬離子和Maillard反應(yīng)產(chǎn)物形成復(fù)雜的復(fù)合物，在反應(yīng)一定時間后該復(fù)合物通過自身或和其他反應(yīng)產(chǎn)物之間的進(jìn)一步反應(yīng)可能使復(fù)合物中的金屬離子以活性更強(qiáng)的自由金屬離子的形式被重新釋放出來，進(jìn)而催化Maillard反應(yīng)[24]。因而，金屬離子對于AGEs生成的影響不僅和反應(yīng)物類型、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間以及反應(yīng)介質(zhì)等有關(guān)，而且和金屬離子本身有關(guān)。

Baynes等[30]認(rèn)為氧化應(yīng)激能促進(jìn)并加速體內(nèi)AGEs的形成，而在John等[31]研究氧氣對Maillard反應(yīng)影響的實驗中，其結(jié)果顯示雖然無氧條件能較好地抑制Maillard反應(yīng)前期中間產(chǎn)物乙二醛和甲基乙二醛的產(chǎn)生，但對后期的反應(yīng)卻并無抑制作用，此外其研究還表示在抗氧化條件下雖能抑制葡萄糖Maillard反應(yīng)的發(fā)生但無法有效地抑制戊糖Maillard反應(yīng)的發(fā)生。還有研究表明[32]，在Maillard反應(yīng)后期會生成具有抗氧化性和消自由基能力的還原酮化合物。故可以推測抗氧化劑對Maillard反應(yīng)的前期進(jìn)程應(yīng)該有較好的抑制作用。目前，對于AGEs抑制劑體內(nèi)體外篩選實驗仍集中在單一的天然抗氧化劑對于模擬生理環(huán)境或食品體系加工中對于AGEs生成的影響。本實驗對于LSOPC與EGCG復(fù)配得到了比單一LSOPC更好地清除DPPH自由基的作用，提示復(fù)配可以提高LSOPC的抗氧化性。因此，本實驗選取LSOPC與EGCG復(fù)配，發(fā)現(xiàn)LSOPC與EGCG在質(zhì)量濃度比為2∶1、2∶9和2∶3時，都具有協(xié)同抑制效果，且2∶1時抑制效果最好。研究結(jié)果旨在為開發(fā)高效復(fù)配型天然AGEs抑制劑提供新思路。

4 結(jié) 論

本實驗探究了LSOPC對于模擬生理體系中AGEs的抑制情況，不同質(zhì)量濃度的LSOPC在37 ℃與BSA和葡萄糖避光密封孵育35 d，其IC50為0.039 mg/mL（95%置信區(qū)間為0.035～0.043 mg/mL）。不同質(zhì)量濃度的不同金屬離子對體外AGEs生成的影響各不相同，其中Cu2+和Fe2+對模擬體系中催化AGEs生成作用最強(qiáng)，并且和LSOPC一起有協(xié)同抑制作用；其他5 種金屬離子對AGEs生成都有不同程度的抑制或促進(jìn)作用，但對LSOPC幾乎無影響。在高糖高蛋白反應(yīng)體系中，發(fā)現(xiàn)LSOPC在高糖高蛋白以及高蛋白情況下，抑制效果最差。發(fā)現(xiàn)LSOPC與EGCG復(fù)配有協(xié)同抑制AGEs效果，并且在LSOPC于EGCG質(zhì)量濃度比為2∶1時最佳。

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