野陽合多糖及其純化組分對膽汁酸的結合能力

岳雨曦，王小燕，柏丁丁，黃毅娜，鐘 凱,*，高 鴻

（1.四川大學輕紡與食品學院，四川 成都 610065；2.四川大學華西公共衛生學院，四川 成都 610041）

野陽合（Habenaria ciliolaris Kranzl）為雙子葉蘭科植物[1]，亦稱毛葶玉鳳花[2]、洋合[3]。主要分布于長江流域及以南各省區。野陽合作為一種富含膳食纖維、蛋白質、氨基酸、維生素及礦物元素等的野生蔬菜[4]，在湖南[4]、湖北[5]、川南等地區有悠久的食用歷史，可涼拌、炒食、醬藏、腌漬，也可制作果脯、果汁等，深受當地人民喜愛。研究顯示野陽合原為野生，生命力極強，無需藥物制劑防治病蟲害，屬純天然綠色食品[3]。野陽合資源豐富，產量高，經濟效益顯著，每667 m2的年收益高達5 000 元以上[3]。

多糖是由十個以上的單糖通過糖苷鍵聚合而成的天然高分子化合物，具有促進免疫調節、抗腫瘤及降血脂等生物功能，且安全、無毒，備受國內外研究者青睞，是食品、醫藥、農業等領域研究的熱點[6]。多糖的提取宗旨是，在不破壞多糖基本性質的基礎上實現有效提取。多糖是極性大分子，不溶于有機試劑，難溶于冷水，易溶于熱水，多糖的傳統提取方法多為熱水提取[7]。對野陽合的研究，目前主要集中在無公害栽培技術[3]和資源開發利用[4]方面，有關野陽合多糖的研究目前鮮見報道。本研究擬采用水提醇沉法初步探究野陽合多糖結構等特征。多糖對膽汁酸的結合被認定為其降低膽固醇的機理之一。多糖通過對膽汁酸的結合，防止其重吸收，并刺激血漿和肝臟中的膽固醇轉化為膽汁酸，消耗更多的膽固醇[8]。野陽合富含膳食纖維，本研究擬通過模擬腸道內環境，探究野陽合多糖體外結合膽汁酸的能力。

本研究以野陽合為原料，提取野陽合粗多糖，采用DEAE-纖維素52柱和TOYOPEARL HW-65柱分離純化得到4 種多糖組分，對其理化性質、結構特點以及對膽汁酸的結合能力進行研究，為野陽合在輔助降血脂功能食品中的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野陽合，采自四川雅安，由四川農業大學徐正君教授鑒定為野陽合（Habenaria ciliolaris Kranzl），常溫陰干后保存于四川大學食品工程系備用。

DEAE-纖維素52 合肥博美生物科技有限公司；TOYOPEARL HW-65 日本TOSOH公司；單糖標準品（鼠李糖、葡萄糖、巖藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖） 美國Supelco公司；葡聚糖標準品（T9、T60、T130、T400、T990、T1740、T3750） 美國Sigma-Aldrich公司；膽汁酸 源葉生物科技有限公司；豬胰酶 銳陽生物科技有限公司；氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸、乙腈、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、三氟乙酸、溴化鉀 成都科龍化工試劑廠。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AU480全自動生化分析儀 美國Beckman Coulter公司；SARNSPEED 1736R高速冷凍離心機 丹麥Labogene公司；BSA224S分析天平 德國Sartorius公司；SPECTRA MAX190酶標儀 美國Molecular Devices公司；高效液相色譜系統（配有蒸發光散射檢測器-LT II檢測器） 日本Shimadzu公司；LGJ-50F冷凍干燥機北京松源華興科技發展有限公司；RV10CS25旋轉蒸發儀德國IKA公司；Nicolet 6700紅外光譜儀 美國Thermo公司；BSZ-100自動部分收集器、HL-系列數顯轉速恒流泵 上海市青浦瀘西儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 野陽合粗多糖的提取

參照Huang Danmin等[9]報道的水提醇沉法。稱取野陽合干品100 g，經90%乙醇溶液脫脂脫色，抽濾，烘干濾渣，按料液比1∶50（g/mL）加入90 ℃的熱水，攪拌浸提4 h，重復3 次，合并提取液并減壓濃縮；將濃縮液與Sevag試劑（三氯甲烷-正丁醇（4∶1，V/V））按體積比1∶1混合脫蛋白，8 000 r/min離心15 min，得上層溶液即為多糖溶液；經磁力攪拌透析48 h（透析袋截留分子質量為3 500 Da）[10]，4 ℃醇沉12 h，真空冷凍干燥，得野陽合粗多糖（記作YP）。

1.3.2 野陽合多糖的分離純化

1.3.2.1 DEAE-纖維素52離子交換柱層析純化

稱取野陽合粗多糖0.1 g，溶于10 mL超純水，上樣至DEAE-纖維素52柱（3 cm×50 cm），依次用超純水、0.1、0.3 mol/L和0.5 mol/L NaCl溶液洗脫[11]，流速1.5 mL/min，每管收集洗脫液3 mL，苯酚-硫酸法檢測并收集A490nm大于0.1的多糖組分，透析除鹽，真空冷凍干燥得初步分離純化的多糖組分YP1、YP2和YP3。

1.3.2.2 TOYOPEARL HW-65凝膠柱層析純化

稱取初步分離得到的各多糖組分0.05 g溶于5 mL超純水，上樣至TOYOPEARL HW-65凝膠柱層析柱（2.6 cm×70 cm）[12]，用超純水洗脫，流速為1 mL/min，每管收集洗脫液3 mL，苯酚-硫酸法檢測并收集A490nm大于0.1的多糖組分，透析除鹽，真空冷凍干燥得到純化野陽合多糖組分，分別為YP1-1、YP2-1、YP2-2和YP3-1。

1.3.3 野陽合粗多糖的總糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[13]測定野陽合多糖的總糖含量。以葡萄糖為標準品，標準曲線回歸方程為：Y=4.878 2X+0.060 2（R2=0.995），其中，X為多糖質量濃度，Y為490 nm波長處樣品的吸光度。取野陽合粗多糖配制成質量濃度為0.1 mg/mL的多糖溶液，加入1 mL 6%苯酚溶液，渦旋振蕩，再加入5 mL濃硫酸，渦旋振蕩，90 ℃水浴反應20 min后，靜置冷卻至室溫，在490 nm波長處測定吸光度。將吸光度帶入標準曲線計算出野陽合粗多糖的總糖含量。

1.3.4 野陽合多糖的紫外光譜分析

紫外光譜分析法能鑒定多糖樣品中是否還含有蛋白或核酸類雜質[14]。稱取YP1-1、YP2-1、YP2-2和YP3-1，配制成質量濃度為0.5 mg/mL的多糖溶液，用紫外-可見分光光度計在波長200～700 nm范圍內掃描，檢測是否存在蛋白質和核酸的特征吸收峰。

1.3.5 野陽合多糖的純度鑒定和分子質量測定

采用高效液相色譜與蒸發光散射檢測器聯用測定野陽合多糖純度及分子質量[15]。將標準葡聚糖（T9、T60、T130、T400、T990、T1740、T3750）及YP1-1、YP2-1、YP2-2和YP3-1，分別配制成質量濃度為3 mg/mL的多糖溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾后進樣。以標準葡聚糖樣品分子質量的對數值（lgmw）為縱坐標，以標準葡聚糖樣品出峰時的保留時間（t）為橫坐標，繪制標準曲線。記錄各野陽合多糖組分出峰時的保留時間，代入標準曲線計算出各多糖組分的分子質量，并根據高效凝膠滲透色譜洗脫峰形判斷多糖純度。

色譜條件：TSK-gel G5000PWxl色譜柱（7.8 mm×300 mm，10 μm）；蒸發光散射檢測器-LT II（霧化溫度35 ℃、壓力3.50 bar、檢測靈敏度6）；流動相為雙蒸水；流速0.6 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量20 μL。

1.3.6 野陽合多糖的紅外光譜分析

采用溴化鉀（KBr）晶體壓片法[16]分析野陽合多糖樣品的紅外光譜。分別稱取YP1-1、YP2-1、YP2-2和YP3-1樣品各2 mg，各按質量比1∶100與干燥的KBr混合均勻，在瑪瑙研缽中充分研磨10 min，用壓片機制膜，再用紅外光譜儀在波數4 000～400 cm-1范圍內進行紅外光譜掃描，采用干燥的光譜純KBr作背景對照。

1.3.7 野陽合多糖的單糖組成分析

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）柱前衍生高效液相色譜法測定野陽合多糖的單糖組成[17]。稱取YP1-1、YP2-1、YP2-2、YP3-1和單糖標準品（甘露糖、鼠李糖、巖藻糖、果糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖），分別加入4 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，封管，110 ℃水解6 h，冷卻至室溫，反復加入甲醇減壓蒸干，除去三氟乙酸。蒸干的樣品溶于500 μL蒸餾水，依次加入500 μL 0.3 mol/L的NaOH溶液和500 μL 0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液，混勻；70 ℃水浴反應100 min，取出置于冷水浴中10 min；再加500 μL 0.3 mol/L的HCl溶液中和，用氯仿萃取3 次，0.45 μm微孔濾膜過濾，待高效液相色譜進樣分析。

色譜條件：Archrom Bond-AQ C18反相色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；紫外檢測器，檢測波長254 nm；流動相為0.3 mol/L磷酸鹽（pH 6.7）緩沖液-乙腈（83∶17，V/V）；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

1.3.8 野陽合多糖對膽汁酸的結合能力測定

參照Zeng Hongliang等[18]報道的方法，通過模擬腸道內環境，測定野陽合多糖體外結合膽汁酸的能力。將0.5 mL多糖溶液（5、15 mg/mL和25 mg/mL）和0.25 mL 0.01 mol/L的鹽酸溶液在37 ℃條件下充分攪拌反應1 h，再加入0.1 mol/L的NaOH溶液將混合液pH值調節至6.3。向混合液中加入1 mL膽汁酸混合液（7.2 mmol/L），攪拌混勻，再加入2 mL 10 mg/mL的豬胰酶溶液，提供消化用胰淀粉酶、胰蛋白酶和胰脂肪酶。37 ℃條件下充分攪拌反應1 h后，再加入20 mL無水乙醇，4 ℃醇沉12 h，8 000 r/min冷凍離心15 min，保留上清液。通過全自動生化儀測定上清液中膽汁酸含量。辛伐他汀為陽性對照。計算野陽合多糖相比于辛伐他汀對膽汁酸的結合能力。

1.4 數據分析

數據取3 次平行實驗結果的平均值，采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件對實驗數據進行方差分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 野陽合多糖的提取與柱層析分離純化

野陽合經熱水浸提、Sevag法脫蛋白、透析、醇沉、真空冷凍干燥處理后得野陽合粗多糖，提取率為2.41%，其總糖質量分數為96.35%。

圖1 野陽合粗多糖經DEAE-纖維素52柱層析分離的洗脫曲線Fig.1 Elution curve of YP on DEAE-cellulose 52 column

野陽合粗多糖經DEAE-纖維素52離子交換柱分離純化后，以洗脫管數為橫坐標，苯酚-硫酸法測得490 nm波長處的吸光度為縱坐標，繪制洗脫曲線如圖1所示。各組分洗脫峰狹窄對稱，表明分離效果好[19]。其中，經超純水洗脫出的不帶電荷的中性多糖組分為YP1[20]，依次經0.1、0.3 mol/L和0.5 mol/L NaCl溶液洗脫出的組分為YP2、YP3和YP4。收集含量較大的YP1、YP2和YP3組分，經透析除鹽、冷凍干燥后，采用TOYOPEARL HW-65凝膠層析柱進一步純化。多糖組分YP1和YP3洗脫后均得到單一洗脫峰，分別為YP1-1和YP3-1，多糖組分YP2洗脫后得到2 個洗脫峰，分別為YP2-1和YP2-2。經冷凍干燥后，即得4 種蓬松狀、呈白色的純化野陽合多糖YP1-1、YP2-1、YP2-2和YP3-1。

2.2 野陽合多糖的紫外光譜分析

圖2 野陽合粗多糖在波長200～700 nm的紫外掃描圖譜Fig.2 UV absorption spectrum of YP

如圖2所示，多糖樣品溶液在波長260 nm和280 nm處均無明顯吸收峰，表明其不含蛋白質及核酸雜質。這是由于Sevag試劑能使蛋白質變性，而且DEAE-纖維素52離子交換柱不僅能分離純化野陽合多糖，還能有效去除色素及殘余蛋白[21]。

2.3 野陽合多糖的純度鑒定和分子質量測定

多糖的分子質量具有相對性，通常測定的分子質量是一種統計平均值，代表相似鏈長多糖分子質量平均值[22]。采用高效液相色譜與蒸發光散射檢測器聯用測定分離純化得到的4 種多糖組分YP1-1、YP2-1、YP2-2和YP3-1的分子質量，結果如圖3所示。4 種多糖均為單一峰，對稱性較好，說明其純度較高，分離純化效果較好。采用高效液相色譜與蒸發光散射檢測器聯用，測定的葡聚糖標準品分子質量的標準曲線回歸方程為：lgmw=-0.398 8t+10.420（R2=0.983），計算得出YP1-1、YP2-1、YP2-2和YP3-1的分子質量分別為3.52×106、3.08×106、1.93×106Da和3.35×106Da。

圖3 4 種純化野陽合多糖組分YP1-1、YP2-1、YP2-2、YP3-1的高效凝膠滲透色譜圖Fig.3 HPGPC chromatograms of YP1-1, YP2-1, YP2-2, and YP3-1

2.4 野陽合多糖的紅外光譜分析

圖4 4 種純化野陽合多糖組分YP1-1、YP2-1、YP2-2、YP3-1的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of YP1-1, YP2-1, YP2-2, and YP3-1

如圖4所示，4 種野陽合多糖組分均在3 370～3 400 cm-1范圍內出現寬而強的吸收帶，它們是分子內或分子間氫鍵的O-H伸縮振動的結果[23]；在2 920～2 940 cm-1范圍內出現的吸收帶是糖類C-H伸縮振動的結果；在1 720～1 750 cm-1范圍內出現的強吸收帶是多糖樣品中乙酰基、酯基或羧基中C＝O非對稱伸縮振動的結果；在1 600～1 640 cm-1范圍內出現吸收帶，表明多糖含有一定量的結合水；在1 400～1 430 cm-1范圍內出現的吸收帶是糖類C-H變角振動的結果；在1 320～1 340 cm-1范圍內出現的吸收帶是羰基O-H彎曲振動的結果；在1 230～1 280 cm-1范圍內出現的吸收帶是乙酰基（C-O）伸縮振動的結果。YP1-1、YP2-1及YP2-2在1 100～1 000 cm-1范圍內均出現3 個較強的吸收帶，表明YP1-1、YP2-1及YP2-2含有吡喃糖，YP3-1在1 100～1 000 cm-1范圍內出現2 個較強的吸收帶，表明其含有呋喃糖和吡喃糖；YP1-1在892.89 cm-1處出現的吸收帶，表明其糖苷鍵以β-構型為主；YP2-1在894.82 cm-1和829.25 cm-1處出現的吸收帶，表明其糖苷鍵有β-構型和α-構型；YP2-2在890.97 cm-1和829.25 cm-1處出現的吸收帶，表明其糖苷鍵有β-構型和α-構型；YP3-1在889.04 cm-1處出現的吸收帶，表明其糖苷鍵以β-構型為主。

2.5 野陽合多糖的單糖組成分析

圖5 單糖標準品（A）、4 種純化野陽合多糖組分（B～E）的單糖組成高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of mixed monosaccharide standards (A)and purif i ed polysaccharide fractions (B through E)

表1 4 種純化野陽合多糖組分YP1-1、YP2-1、YP2-2、YP3-1的單糖組成Table1 Monosaccharide composition of YP1-1, YP2-1, YP2-2 and YP3-1

對4 種野陽合多糖組分YP1-1、YP2-1、YP2-2、YP3-1和單糖標準品（甘露糖、鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖和半乳糖）進行PMP柱前衍生化高效液相色譜分析，如圖5所示，單糖組成物質的量比見表1。YP1-1、YP2-1、YP2-2和YP3-1均為雜多糖。YP1-1的單糖組成為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其物質的量比為1.08∶2.01∶9.89∶29.14∶1.02，說明YP1-1是主要由葡萄糖和半乳糖構成的中性多糖；YP2-1的單糖組成為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖，其物質的量比為1.84∶2.87∶16.76∶8.08∶1.78∶0.08；YP2-2的單糖組成為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖，其物質的量比為2.93∶5.03∶25.55∶15.87∶3.37∶1.83；YP3-1的單糖組成為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其物質的量比為1.01∶13.46∶8.84∶5.17∶1.00。對比發現，野陽合多糖的單糖組成和蘭科植物金線蓮[24]、鐵皮石斛[25]、白及[26]多糖的單糖組成類似，金線蓮[24]和鐵皮石斛[25]多糖均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖，5 種單糖組成；白及[26]多糖由巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，5 種單糖組成。

2.6 野陽合多糖對膽汁酸的結合能力

圖6 野陽合多糖對膽汁酸的結合能力Fig.6 Bile acid-binding abilities of crude and purif i ed polysaccharides from Habenaria ciliolaris Kranzl

多糖能降低膽固醇，對膽汁酸的結合是多糖降低膽固醇的機理之一[27]。多糖通過結合膽汁酸，防止其重吸收，并刺激血漿、肝臟中的膽固醇轉化為膽汁酸，達到消耗更多膽固醇的目的。陽性對照辛伐他汀是一種有效的降膽固醇藥物，能有效增加膽汁酸分泌、降低膽固醇吸收[28]。野陽合粗多糖及4 種純化多糖組分YP1-1、YP2-1、YP2-2和YP3-1對膽汁酸的結合能力如圖6所示。辛伐他汀（5 mg/mL）能結合大量的膽汁酸，定義其結合率為100%。野陽合粗多糖（YP）及YP1-1、YP2-1、YP2-2和YP3-1（5、15 mg/mL和25 mg/mL）對膽汁酸的結合率均高于97%。其中，25 mg/mL野陽合粗多糖對膽汁酸的結合率高達100.7%，有強膽汁酸結合能力。同時，研究發現低濃度和高濃度野陽合多糖對膽汁酸的結合能力無顯著性差異（P＞0.05），該結果與Hu Jielun等[29]的報道一致。有報道發現多糖對膽汁酸有結合能力的一部分原因是多糖有高黏度，能通過水動力學限制作用綁定膽汁酸[30]。此外，這種結合與多糖的陰、陽離子及其物理化學結構有關[31]。野陽合多糖分子質量在1.93×106～3.52×106Da范圍內，分子質量大，具有膳食纖維屬性[32]，能通過結合膽汁酸，增加膽汁酸的糞便排出量，抑制腸壁對膽汁酸的重吸收，刺激血漿和肝臟中膽固醇的轉化[33]。

3 結 論

利用水提醇沉法提取野陽合粗多糖，提取率為2.41%，其總糖質量分數為96.35%，紫外光譜檢測結果顯示其不含蛋白質和核酸。經DEAE-纖維素52柱和TOYOPEARL HW-65柱分離純化得到4 種多糖組分，分別為YP1-1、YP2-1、YP2-2和YP3-1。采用高效液相色譜與蒸發光散射檢測器聯用，測定4 個純化組分的分子質量，分別為3.52×106、3.08×106、1.93×106Da和3.35×106Da。紅外光譜分析結果表明各野陽合多糖主要為吡喃型糖苷環骨架，糖苷鍵以β-構型為主。PMP柱前衍生化高效液相色譜分析表明，各野陽合多糖純化組分的單糖組成均以半乳糖、葡萄糖和鼠李糖為主。水提醇沉法適用于植物多糖的初步探究，但利用水提醇沉法提取野陽合多糖，提取率僅為2.41%。后續可根據野陽合多糖的結構和性質，選用酸堿提取法、生物酶解提取法、超聲提取法、微波提取法等，提高野陽合多糖的提取率。

對膽汁酸結合能力的實驗結果表明，各野陽合多糖對膽汁酸均有較強的結合能力，結合率均高于97%。其結合膽汁酸的具體作用機制，后續可從野陽合多糖的流變學特性及陰、陽離子組成等方面進行探究。以上實驗結果為進一步深入探究野陽合多糖的結構和生物活性提供了參考，也為提升野陽合的產業價值，提供了新的思路。

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