糖脅迫下魯氏接合酵母的代謝指紋分析

韓曉江，徐志嬌，岳田利，牛 晨，魏建平，蔡 瑞*，袁亞宏*

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是一類能夠在高滲透壓培養條件下（高糖或高鹽環境中）生長的酵母菌。魯氏接合酵母在pH值為1.5～7.5的范圍內均可以生長，最適生長的pH值為3.0～4.0。在溫度為15～35 ℃的范圍內能夠生長，最適生長的溫度為25～30 ℃[1]。魯氏接合酵母可以用來生產發酵食品，也存在于高糖食品中，在合適條件下能夠引起高糖食品腐敗變質。由于高糖環境對高滲酵母生長具有抑制作用，高滲酵母污染高糖食品后生長比較緩慢，但是貯存溫度的快速變化會導致高糖食品表面生成冷凝水，從而降低糖濃度，加速高滲酵母在高糖食品表面的生長[2]。

目前對魯氏接合酵母的研究主要集中在兩個方面：一是高滲酵母耐高滲機理的研究，代謝通路以及基因分子；二是高滲酵母發酵的應用，對食品的危害以及控制方面等。鄭聃等[3]研究得出釀酒酵母和魯氏接合酵母細胞內積累的海藻糖含量均隨著NaCl濃度的升高而遞增，2 種酵母菌胞內甘油含量均隨脅迫鹽濃度的增加而上升，在0.9 mol/L NaCl脅迫下胞內甘油含量均達到最高值，當NaCl濃度大于0.9 mol/L時胞內甘油含量均有所下降。Tikam等[4]研究發現在鹽和糖條件下，魯氏接合酵母產生甘油和阿拉伯糖醇，如果糖用作應激劑而不是鹽，則D-阿拉伯糖醇高度產生和積累，而甘油濃度保持不變。Hosono[5]研究發現在15 g/100 mL NaCl溶液條件下，相對于基本培養基，細胞膜脂肪酸C16∶1、C18∶1含量增加，C18∶0、C18∶2含量減少，脂肪酸不飽和度降低，麥角甾醇含量增加了2.9 倍，麥角甾醇對磷脂比率增加了5 倍。Guo Hong等[6]對不同糖度條件下魯氏接合酵母細胞總蛋白進行了研究，發現168 個蛋白點不同，鑒定出47 個蛋白點，這些蛋白參與糖代謝、能量代謝、氨基酸代謝等。Wei Yonghua等[7]利用基因組改組獲得高度耐鹽的魯氏接合酵母突變株，其在鹽條件下增強ZrGPD1轉錄并降低ZrFPS1的轉錄，研究發現魯氏接合酵母在鹽條件下都依賴甘油生產的感應和抑制促進甘油通過質膜擴散。此外，對魯氏接合酵母的應用方面也有所研究，利用魯氏接合酵母發酵生產中間代謝產物以及釀造醬油等。Taing等[8]研究發現，30%葡萄糖、初始pH 5.0和25 ℃培養溫度時，魯氏接合酵母發酵產生的蘋果酸和琥珀酸量最大。吳雅男[9]研究在不同醬油釀造工藝中分別添加魯氏接合酵母S和S3-2并考察其風味物質變化，實驗結果表明，添加酵母組檢測到的風味物質的種類和含量均多于空白組，說明添加魯氏接合酵母對醬油的釀造其風味物質有著重要作用。在含糖量較高的果汁中，較低的水分活度能夠抑制腐敗菌和致病菌的生長[10]，但高滲酵母能夠繼續生長，從而對果汁的品質造成一定的影響。主要包括以下3 個方面：1）高滲酵母為適應高滲環境，代謝一些相容性物質，如生成強烈的酒精等令人不愉快氣味，引起果汁渾濁，顏色加深，在果汁表面形成菌膜或在果汁底部形成白色沉淀，破壞果汁的感官風味并降低其營養價值[11]；2）高滲酵母代謝過程中產生CO2等氣體，會引起脹袋脹氣，從而使果汁發生腐敗，危害消費者健康[12]；3）高滲酵母生長過程中會代謝掉糖類等固形物質，使果汁中的固形物含量降低，果汁中溶質的溶解性發生變化，從而使水分活度升高，致使腐敗菌生長，導致產品質量不合格，造成企業損失。

近年來，很多學者從魯氏接合酵母產生的甘油、海藻糖，細胞壁、細胞膜以及蛋白質方面研究魯氏接合酵母耐高滲的機理，尚鮮有從魯氏接合酵母在糖質量分數80%的高滲培養條件下所產生的細胞外、胞內全物質進行研究的報道。本研究采用頂空固相微萃取法和氣相色譜-質譜技術聯用對魯氏接合酵母胞外物質檢測分析，利用硅烷化衍生-氣相色譜-質譜聯用技術對魯氏接合酵母胞內物質檢測分析，可見分光光度計測定酵母生長OD值，采用主成分分析（principal components analysis，PCA）、正交偏最小二乘方判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）模型進行得分分析，對其物質差異性分析，為研究魯氏接合酵母耐高糖滲透壓提供理論依據；對酵母胞內外代謝指紋分析，從物質成分角度闡述魯氏接合酵母耐高滲；此外，本研究對高糖環境下食品受到魯氏接合酵母污染的檢測及其污染控制都有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魯氏接合酵母1130、釀酒酵母2#（Saccharomyces cerevisiae）均由西北農林科技大學食品學院健康食品制造與安全控制工程實驗室提供。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉（均為分析純）北京奧博星生物技術有限責任公司；甲基鹽酸鹽、N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺（N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，MSTFA） 上海源葉生物有限公司；3-辛醇（氣相色譜標準品，純度＞98%） 日本東京化成工業株式會社；吡啶 天津市科密歐化學試劑有限公司；氯化鈉（分析純） 四川西隴化工有限公司。

1.2 儀器與設備

HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；YXQ-LS-70A型立式壓力蒸汽滅菌器上海博迅實業有限公司醫療設備廠；UV-1700紫外-可見分光光度計、120150-T230L氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司；MD200-1氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司；YT-CJ-2ND型超凈工作臺 北京亞泰科隆儀器技術有限公司；ZWY-240恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化與培養

將保存在甘油管的魯氏接合酵母1130、釀酒酵母2#自然條件下解凍后，置于滅菌后的YPD培養基中進行活化，于28 ℃、120 r/min搖床中培養24 h。取第1代活化的種子液以2%的接種量接種于滅菌完成的YPD液體培養基中，28 ℃、120 r/min搖床中進行培養，待菌液濃度達到108CFU/mL后，作為種子液待用。分別配制糖質量分數2%（基本培養條件）、80%（高滲培養條件）的YPD培養基，魯氏接合酵母接種量2%分別接種于2%（記為Z1）、80%（記為Z2）糖的YPD培養基中，釀酒酵母以2%接種量接種于2%糖（記為S1）的YPD培養基中，于28 ℃、120 r/min搖床中進行培養。期間定時取樣測OD值，并取對數期樣品進行實驗。

1.3.2 酵母生長情況分析

根據王虎玄等[11]對魯氏接合酵母生長的研究，采用YPD平板涂布稀釋法進行計數，取樣采用紫外分光光度計在600 nm波長下測定OD值，重復3 次，取平均值。

1.3.3 胞外物質的測定

1.3.3.1 樣品制備與前處理

根據宋江等[13]測定方法進行改進。YPD培養基培養的菌液生長到對數期時，取4 mL于10 mL離心管中10 000 r/min離心10 min，上清液轉移至固相萃取樣品瓶中，每個樣品瓶中加入1.2 g氯化鈉、3 μL質量濃度為3.267 mg/L的3-辛醇溶液，上機測定。

1.3.3.2 色譜條件

色譜柱：DB-17MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；采用自動進樣，進樣口溫度250 ℃，載氣為He，流速1.8 mL/min，不分流進樣。程序升溫：起始溫度40 ℃，保持3 min后以4 ℃/min的速度升溫至120 ℃，再以6 ℃/min的速度升溫至240 ℃，保持9 min。

1.3.3.3 質譜條件

電子電離源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，接口溫度為230 ℃，質量掃描范圍m/z 35～500。

1.3.4 胞內物質的測定

1.3.4.1 胞內物質的淬滅與提取

根據Kim等[14]測定方法進行改進。菌液培養至對數期，取5 mL菌液緩慢加入到含20 mL預冷（-20 ℃）淬滅試劑（體積分數60%甲醇溶液）的50 mL離心管中，于-20 ℃淬滅30 min，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取出倒掉上清液，用5 mL清洗劑進行清洗2 次，離心5 min，去上清液。2.5 mL無水甲醇（-40 ℃）重懸酵母泥，冷凍3 次，離心5 min，吸取上清液，再加2.5 mL無水甲醇（-40 ℃），渦旋30 s，離心5 min，合并兩次上清液，氮氣吹干。

1.3.4.2 胞內物質的衍生

離心管中淬滅、提取的胞內物經氮氣吹干后，向每個離心管中加入100 μL含20 mg/mL甲基鹽酸鹽的吡啶溶液，30 ℃水浴2 h，進行污化反應。反應結束后，再向每個樣品中加入100 μL的MSTFA溶液，37 ℃水浴反應30 min，過0.22 μm濾膜，上機測定。

1.3.4.3 色譜條件

色譜柱：DB-17MS毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；采用自動進樣，進樣口溫度270 ℃，載氣為He，不分流進樣，進樣體積1 μL，程序升溫：起始溫度150 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速度升溫至270 ℃，保持24 min。

1.3.4.4 質譜條件

電子電離源，電子能量為70 eV，離子源溫度為250 ℃，接口溫度為280 ℃，質量掃描范圍m/z 80～500。

1.3.5 定性與定量

氣相色譜-質譜測定的圖譜，根據保留時間、NIST14質譜數據庫和相似度對檢測出的各個物質進行匹配，相似度大于80的物質作為檢測出物質成分進行定性分析。胞外物質成分根據加入的3-辛醇含量，計算檢測出的各個物質含量，重復取平均值。

1.4 數據處理

數據用Excel軟件處理，SIMCA-P軟件對各物質做PCA模型、PLS-DA模型分析。

2 結果與分析

2.1 魯氏接合酵母、釀酒酵母生長期間OD值變化

圖1 酵母生長期間OD值變化Fig.1 Changes in OD value during yeast growth

由圖1可知，Z2的適應期時間基本在45 h，這與王虎玄等[11]研究的溫度與pH值條件對魯氏接合酵母生長影響的研究適應趨勢基本一致，在80%高糖質量分數條件下，魯氏接合酵母為了適應高滲環境，會改變細胞組成以及產生相容性物質抵御高滲環境帶來的沖擊。此研究中，滲透壓較高，適應時間在45 h左右，Z2在45～70 h處于緩慢生長，70～100 h生長速率較快，此時期也處于對數時期，后期生長變慢趨于穩定。S1、Z1的適應時間較短，S1在12 h后對數期就結束，生長較慢趨于穩定，Z1的適應時間比S1長2 h，在24 h后生長變慢趨于穩定，但到穩定期時Z1比S1的OD值高，可以達到3.01，而S1趨于穩定時OD值為2.78，Z2達到穩定期時OD值為2.01。

2.2 胞外物質成分分析

表1 S1、Z1、Z2發酵胞外物質成分及其質量濃度Table1 Concentrations of extracellular compounds from Z. rouxii and S. cerevisiae mg/L

續表1 mg/L

續表1 mg/L

如表1所示，Z2共36 種，其中醇類9 種，酯類16 種，酸類3 種，無酮類物質；Z1共47 種，其中醇類9 種，酯類12 種，酸類5 種，酮類6 種；S1共45 種，其中醇類9 種，酯類10 種，酸類5 種，酮類6 種。在Z2以醇類、酯類居多，與Z1、S1比較沒有產生酮類化合物。

2.3 胞外物質的PCA

根據已有報道[15-16]利用PCA、PLS-DA模型對檢測物質的分析，采用無監督的PCA模型對S1、Z1、Z2胞外物質分析，見圖2。

圖2 S1、Z1、Z2發酵胞外物質PCA圖Fig.2 PCA score plot of extracellular substances from Z. rouxii and S. cerevisiae

軟件自動對數據進行模型擬合分析，共獲得2 個主成分，R2X=0.881，Q2=0.702。由圖2可以觀察到，S1、Z1、Z2分別分布在PCA得分圖不同的區域，顯示S1、Z1、Z2具有顯著差異。一般來說R2X值大于0.4表示該模型可靠，此研究中PCA的R2X=0.881，因此當前PCA模型能可靠地用于解釋S1、Z1、Z2樣本之間的差異性。

2.4 胞外物質的PLS-DA分析

采用有監督的PLS-DA模型對S1、Z1、Z2胞外物質進行更進一步分析[17-20]，見圖3。并通過PLS-DA模型VIP（variable importance in the projection）值（閾值＞1）尋找它們之間的差異物質，PLS-DA模型主成分的VIP值如圖4所示。

從圖3可以觀察到，S1、Z1、Z2在得分圖可以完全分開，R2=0.996 7，Q2=0.980 7，兩者都接近1，說明所建模型可信度高，Z1、Z2在得分圖完全分開，說明80%糖的高滲透壓與2%糖條件下魯氏接合酵母生長所產生的物質有顯著差異；S1、Z1是在2%糖條件下生長的不同菌種，兩者也可以分開，說明不同的菌種也有顯著差異。Z2能夠在高滲透壓下生長，為了篩選出受高糖滲透壓影響的標志性代謝物，選取VIP值大于1的差異變量，并是Z2產生的物質，43、44、46、53、51、40和41號物質，即7-辛烯酸乙酯、3-（甲硫基）丙基乙酸酯、2-十三烷醇、十五烷酸-3-甲基丁酯、9-癸烯酸乙酯、3-（甲硫基）-1-丙醇、2-癸醇7 種物質，同時這些醇類、酯類也賦予了特殊的氣味和風味。在高滲培養條件下，為了適應高滲環境，魯氏接合酵母會產生一些特殊的物質來抵御高滲環境，主要是醇類物質，此研究檢測出3 種醇類物質。

圖3 S1、Z1、Z2發酵胞外物質PLS-DA圖Fig.3 PLS-DA score plot of extracellular substances from Z. rouxii and S. cerevisiae

圖4 PLS-DA模型主成分的VIP值Fig.4 VIP values of principal components in the PLS-DA model

2.5 胞內物質成分分析

對Z1、Z2培養至對數期的菌液淬滅、提取、硅烷化衍生后，氣相色譜-質譜聯用上機測樣，根據NIST 14質譜數據庫對各物質進行匹配，進行定性分析，挑選匹配度大于80的物質，其分類及百分比見表2，Z1、Z2各物質成分見表3。

魯氏接合酵母為了適應高滲環境，會產生一些相容性物質使細胞能夠適應高滲透壓環境，生長時期、碳源、氮源不同，產生的物質種類和含量也會有差別[21]，主要是一些醇類、糖類物質，還會有酮類物質。由表2可以看出，Z2與Z1相比較，物質數量減少，醇類物質增加了2 種，但百分占比較Z1低，酸類物質百分占比無太大變化；酯類物質Z2比Z1物質少了6 種，百分占比降低至13.72%，降低幅度較大，這也說明魯氏接合酵母實際運用中，在基本的葡萄糖含量條件下產生的酯類種類含量較高，在醬油生產中，魯氏接合酵母能夠產生較多的風味物質[22]；糖類種類及含量增加，魯氏接合酵母為了適應高糖環境，會產生海藻糖、中間代謝的麥芽糖及其他糖類物質，來抵御外界的高滲環境，產生的糖類物質促進了魯氏接合酵母在高糖環境下的生長，同時氨基酸百分占比增加。研究結果表明，Z2產生的醇類、糖類、氨基酸類物質是主要增加的物質，Tikam等[4]綜述的魯氏接合酵母對食品中糖脅迫下的反應會使酵母細胞產生甘油等醇類、海藻糖等糖類以及代謝物變化，與本研究相似。表3中Z1、Z2產生的相同物質有23 種，Bubnova等[23]研究魯氏接合酵母耐鹽調節方式中，檢測到甘油、海藻糖的含量是動態變化的，但一直存在魯氏接合酵母生長中，在本研究Z1、Z2產生的不同物質中，也檢測到甘油、海藻糖。產生的麥芽糖也在一定程度上促進魯氏接合酵母耐高滲，以麥芽糖為底物，海藻糖在海藻糖合成酶催化下以TreS途徑進行生物合成[24]，本研究Z2產生的麥芽糖說明海藻糖在高糖環境下是以TreS途徑合成的海藻糖。Z1、Z2都檢測到角鯊烯，說明兩者都在生長過程生成了角鯊烯，但在不同物質中，Z1檢測到了膽固醇，而Z2檢測到的是羊毛固醇，鯊烯可以與固醇載體蛋白接合，經加氧酶、環化酶催化反應，生成羊毛固醇，再經一系列氧化、脫羧、還原步驟，生成膽固醇，Z1產生了膽固醇，說明此反應鏈完整；Z2只產生了羊毛固醇，研究表明，在高糖條件下，膽固醇反應鏈被切斷或者還沒到膽固醇的合成這一步驟，也有可能羊毛固醇這一物質能夠抵御高滲環境，羊毛固醇在此反應鏈中積累，而不再進行下一步反應。Z1產生了尿素、戊二胺、丁二胺等含氮物質，Z2并沒有產生含氮的化合物，高糖滲透環境下魯氏接合酵母對氮的代謝有所減弱，說明高糖影響了氮代謝。酪氨酸脫氨基可以參與延胡索酸的合成，賴氨酸參與乙酰CoA的合成，半胱氨酸參與丙酮酸的合成，說明在高糖環境下產生的這些氨基酸間接影響了魯氏接合酵母耐高滲，此外，景天庚酮糖、木糖醇、D-木糖、D-半乳糖也可參與碳水化合物的代謝[25-30]。

表2 Z1、Z2胞內物質種類Table2 Classes of intracellular materials from Z. rouxii

表3 Z1、Z2胞內物質成分Table3 Comparison of intracellular materials from Z. rouxii under two culture conditions

3 結 論

在高糖滲透壓下，魯氏接合酵母Z2適應期達45 h，菌體呈對數生長，生長100 h后趨向穩定，但生長穩定后，其OD值低于基本培養條件下的OD值。

采用固相微萃取，通過氣相色譜-質譜檢測酵母胞外物質，高滲培養條件下魯氏接合酵母共有36 種；基本培養條件下魯氏接合酵母共有47 種；基本培養條件培養釀酒酵母共45 種。得到高滲培養條件下魯氏接合酵母的特征性物質為7-辛烯酸乙酯、3-（甲硫基）丙基乙酸酯、2-十三烷醇、十五烷酸-3-甲基丁酯、9-癸烯酸乙酯、3-（甲硫基）-1-丙醇、2-癸醇。

采用硅烷化衍生處理，氣相色譜-質譜檢測酵母胞內物質，高糖滲透壓與基本培養條件下魯氏接合酵母產生了27 種不同的物質，沒有產生含氮化合物，氮代謝受到了影響，此外這些物質參與糖代謝、能量代謝，其中海藻糖在高糖環境下是以TreS途徑合成的海藻糖。本研究為后續研究魯氏接合酵母耐高糖滲透壓提供了理論依據，對魯氏接合酵母的檢測以及控制都有重要的意義，對于產生的差異性物質誘導基因的形成和其耐高滲機理還需進一步研究。

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