β2腎上腺素受體基因的改造及在無細(xì)胞合成體系中的表達(dá)

王 健，劉 媛，王 瑋，劉 洋，韓正政，曲麗潔，楊立亭，王若敏

（1.河北北方學(xué)院食品安全研究中心，河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測重點實驗室，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院食品研究所，河北 張家口 075000）

β激動劑俗稱“瘦肉精”，食用含有其藥物殘留的畜產(chǎn)品極易引起人的急性中毒及心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的慢性病變[1]，因此我國早已嚴(yán)禁在飼料及飼料產(chǎn)品中將該類藥物作為動物促生長劑使用。目前，多種新型“瘦肉精”替代物的混合添加是監(jiān)管執(zhí)法的重點和難點，迫切需要能同時檢測多種該類違禁物的多殘留高通量檢測技術(shù)。

以大型分析儀器為基礎(chǔ)的確證檢測技術(shù)盡管可實現(xiàn)多種β激動劑的同時檢測[2-7]，但存在操作步驟繁瑣和儀器設(shè)備昂貴等缺點。相比而言，近年來興起的快速檢測技術(shù)融合了傳統(tǒng)免疫分析的特異性與新材料、新型信號識別體系的諸多優(yōu)點，形成了一系列β激動劑快速檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附法[8-9]、膠體金免疫層析法[10-11]，量子點[12]、傳感器[13-14]和電化學(xué)[15-16]等，但它們大多以抗原抗體識別機制為基礎(chǔ)，檢測β激動劑的種類受到了很大限制，制約了方法的推廣應(yīng)用。

受體分析技術(shù)是基于受體和配體特異性結(jié)合原理的一種類特異性識別快速檢測技術(shù)，可實現(xiàn)對某一類具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)物質(zhì)的多殘留檢測和未知物篩查[17]。國外于2005年后開始出現(xiàn)β2腎上腺素受體（β2adrenergic receptor，β2AR）應(yīng)用于β激動劑檢測的報道[18-19]。但由于β2AR屬于具有7 個跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)的膜蛋白[20]，分離純化難度極大，而體外表達(dá)重組受體又存在產(chǎn)量、活性及純度等問題，因此制備大量β2AR活性蛋白成為了困擾該項技術(shù)實際應(yīng)用的最大瓶頸。目前，有關(guān)β2AR表達(dá)的研究大多基于大腸桿菌[21]、酵母細(xì)胞[22]、桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞[23]和哺乳動物細(xì)胞[24]等活細(xì)胞系統(tǒng)，而利用無細(xì)胞體系合成β2AR蛋白的報道極少。無細(xì)胞合成體系是以外源mRNA或DNA為模板，利用細(xì)胞裂解液和額外補充的底物和能量，在細(xì)胞外模擬細(xì)胞內(nèi)蛋白合成與翻譯后修飾的蛋白合成體系。已開發(fā)的無細(xì)胞合成系統(tǒng)主要有兩類，一類是以利用大腸桿菌BL21（DE3）為代表的原核系統(tǒng)，另一類是利用麥芽提取物和兔網(wǎng)織紅細(xì)胞等的真核系統(tǒng)。除細(xì)胞抽提物制備、能量體系構(gòu)成等問題外，無細(xì)胞反應(yīng)的持續(xù)時間及遺傳模板的穩(wěn)定性是影響整個體系蛋白合成效率的兩個關(guān)鍵因素[25]。國外學(xué)者發(fā)明且改進(jìn)了連續(xù)交換式無細(xì)胞反應(yīng)體系[26]，并通過調(diào)整模板自身結(jié)構(gòu)[27]等方式使無細(xì)胞合成體系超過了基于細(xì)胞的體外表達(dá)水平。此外，在某些特殊蛋白質(zhì)特別是活細(xì)胞難于表達(dá)的膜蛋白合成方面，無細(xì)胞合成體系顯示出良好的應(yīng)用前景。

本研究從基因改造、表達(dá)條件優(yōu)化和蛋白純化等多個方面探討不同因素對無細(xì)胞合成體系制備β2AR蛋白的影響規(guī)律，為實現(xiàn)β2AR的大量功能性表達(dá)及β激動劑受體檢測技術(shù)的研發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

T4連接酶、限制性內(nèi)切酶NdeI及XhoI、蛋白純化體系MagneHis? Ni-Particles 美國Promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；pET-22b載體 美國Novagen公司；Brij35去污劑上海語燕生物技術(shù)有限公司；無細(xì)胞蛋白合成體系武漢金開瑞生物工程有限公司；辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠二抗、His鼠源單克隆抗體 美國Sigma公司；HRP標(biāo)記的β激動劑北京勤邦生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

4800聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國AmpGene公司；Gel Doc2000凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；THZ-03M2R恒溫空氣浴搖床上海博彩生物科技有限公司；DYCP-31BN、31CN型DNA電泳儀、DYCZ-24EN型蛋白電泳儀 北京六一儀器廠；Multiskan FC酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 基因改造及合成

依據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性，利用密碼子優(yōu)化網(wǎng)站（http∶//www.jcat.de/）對前期克隆獲得的豬β2AR cDNA基因序列（GenBank：KF023571.1）在不改變氨基酸序列的前提下進(jìn)行改造，并分析其密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaptation index，CAI）和GC含量，以判斷其是否適應(yīng)大腸桿菌表達(dá)。在改造后基因的5’端和3’端分別引入限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI位點，便于后續(xù)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建。改造后的β2AR基因由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，并連入pMD18-T載體，構(gòu)建pMD18-T-β2AR克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Top10克隆菌株，利用氨芐青霉素抗性和藍(lán)白斑篩選陽性克隆，PCR及測序鑒定并保種。

1.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

將pMD18-T-β2AR克隆質(zhì)粒與表達(dá)載體pET-22b分別用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI進(jìn)行雙酶切，然后切膠回收目的基因片段及載體片段，經(jīng)T4 DNA連接酶在16 ℃下連接過夜，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10菌株，采用LB-Amp平板篩選重組子，進(jìn)行PCR鑒定，將初步鑒定為陽性的重組子送上海博亞生物技術(shù)有限公司測序，經(jīng)驗證序列正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-22b-β2AR。

1.3.3 無細(xì)胞體系合成β2AR蛋白

按照無細(xì)胞蛋白合成體系（武漢金開瑞生物工程有限公司提供）的操作要求，將體系中各試劑R1（大腸桿菌細(xì)胞抽提物純化所得的各種轉(zhuǎn)錄因子）、R2（細(xì)胞抽提物純化所得的蛋白質(zhì)合成所需的各種酶系）、R3（氨基酸混合物）、R4（ATP、GTP、UTP、CTP等能量物質(zhì)）、R5（RNA聚合酶）和R6（tRNA）依次加入到55 μL的反應(yīng)杯中。為了避免不溶性蛋白沉淀的產(chǎn)生，還以終質(zhì)量濃度為2 g/100 mL在體系中加入了非離子型去垢劑Brij35。最后在反應(yīng)杯中加入1 μg重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-β2AR，置于30 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床中過夜反應(yīng)，產(chǎn)物于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

為獲得最佳的表達(dá)水平，在K+濃度固定為300 mmol/L的前提下，對Mg2+濃度進(jìn)行了優(yōu)化研究。通過對反應(yīng)產(chǎn)物的Western blot檢測，比較Mg2+濃度分別在14、16、18、20、22 mmol/L時蛋白表達(dá)水平的差異，以確定反應(yīng)體系中最佳的Mg2+濃度。經(jīng)小量表達(dá)優(yōu)化表達(dá)條件后，進(jìn)行大量表達(dá)。Western blot采用半干轉(zhuǎn)膜法，以His小鼠源單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體為二抗。

1.3.4 重組表達(dá)產(chǎn)物的純化

采用負(fù)載鎳離子的順磁性顆粒MagneHis? Ni-Particles對帶有His標(biāo)簽的蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，具體操作流程按照所附說明書進(jìn)行。取適量純化產(chǎn)物進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和活性鑒定。

1.3.5 純化產(chǎn)物的鑒定

采用SDS-PAGE方法檢測所獲得純化蛋白的純化效果。參考前期已建立的直接酶受體分析法（enzymelinked receptor assays，ELRA）測定該純化蛋白與3種β激動劑（鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇）HRP標(biāo)記物的特異性結(jié)合程度，從而判定該純化蛋白對β激動劑的親和活性[28-29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 改造后β2AR基因序列的分析與鑒定

根據(jù)大腸桿菌的偏好性，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在編碼基因的5’端和3’端分別添加限制性內(nèi)切酶NdeI（CATATG）和XhoI（CTCGAG），改造后基因及氨基酸序列如圖1所示。

經(jīng)DNAman軟件分析，改造前后基因序列的一致性為74.86%。基因序列在大腸桿菌表達(dá)宿主中的CAI值由密碼子優(yōu)化前的0.70上升到優(yōu)化后的0.96，CAI值更接近于1，有利于提高在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達(dá)水平。基因序列的GC含量由優(yōu)化前的58%降至46.17%，可進(jìn)一步延長mRNA的半衰期，有利于提高轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。對pMD18-T-克隆質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，在1.3 kb左右出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期片段大小相符，且測序結(jié)果與目的基因堿基完全一致。

圖1 改造后β2AR基因序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 Modif i ed gene and amino acid sequence of β2AR

圖2 pMD18-T-β2AR克隆質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Identif i cation of pMD18-T-β2AR plasmid by PCR

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取陽性重組子進(jìn)行PCR鑒定，如圖3所示，各陽性重組子在1.3 kb左右均出現(xiàn)了目的基因條帶，與預(yù)期大小相符，經(jīng)測序鑒定與目的基因序列完全一致，將該重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-22b-β2AR。

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 Identif i cation of recombinant expression plasmid by PCR

2.3 無細(xì)胞體系表達(dá)條件的優(yōu)化

參照無細(xì)胞蛋白合成體系的操作要求，完成對β2AR的無細(xì)胞表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot鑒定。在K+濃度為300 mmol/L的前提下，對影響表達(dá)水平的重要因素Mg2+濃度進(jìn)行篩選。由Western blot結(jié)果（圖4）分析可知，不同Mg2+濃度下均在47 kDa左右出現(xiàn)特異性條帶，表明該體系成功表達(dá)目的蛋白。Mg2+濃度在14、16、18、20、22 mmol/L時表達(dá)水平分別為950、1 000、500、375、1 250 μg/mL，因此選定表達(dá)水平最高的22 mmol/L為最適宜的Mg2+濃度。

圖4 無細(xì)胞體系中Mg2＋濃度優(yōu)化的Western blot鑒定Fig.4 Western blot analysis of CFPS system at different Mg2+ concentrations

2.4 純化蛋白的SDS-PAGE鑒定

圖5 純化蛋白的SDS-PAGE鑒定結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purif i ed protein

基于表達(dá)產(chǎn)物中含有來自pET-22b表達(dá)載體的His標(biāo)簽，參考MagneHis? Ni-Particles的說明書對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化蛋白采用SDS-PAGE方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖5所示，在47 kDa附近出現(xiàn)清晰的特異性條帶，且周圍幾乎無雜蛋白，純度大于90%。

2.5 純化蛋白的β激動劑親和活性鑒定

按照筆者前期已建立的ELRA方法對純化蛋白進(jìn)行β激動劑親和活性鑒定。如表1所示，純化所得受體蛋白在1∶500和1∶1 000稀釋時，均可與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺的HRP標(biāo)記物發(fā)生特異性吸附。當(dāng)受體蛋白作1∶500稀釋時，OD值分別為0.976、0.836和0.728，親和性由強到弱依次為HRP-克倫特羅＞HRP-沙丁胺醇＞HRP-萊克多巴胺。以上結(jié)果表明純化后的重組受體蛋白仍然保持了特異性識別β激動劑的生物活性。

表1 純化蛋白ELRA鑒定結(jié)果Table1 Identif i cation of the purif i ed protein by ELRA

3 討 論

目前，β2AR蛋白表達(dá)主要有原核系統(tǒng)和真核系統(tǒng)兩種方式。原核表達(dá)缺乏翻譯后修飾易發(fā)生錯誤折疊，表達(dá)蛋白多為包涵體不可溶形式。而真核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白功能活性較之有所提高，但表達(dá)產(chǎn)量往往不能滿足研究需求。與以上活細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比，無細(xì)胞合成體系具有許多優(yōu)點[30]：1）可表達(dá)對細(xì)胞有毒性的某些蛋白質(zhì)，如膜蛋白等，避免其對宿主細(xì)胞的殺傷作用；2）反應(yīng)周期短，產(chǎn)率較高；3）體系具有開放性特點，可通過添加外源物質(zhì)，靈活調(diào)節(jié)反應(yīng)條件以控制蛋白質(zhì)的合成、翻譯、修飾加工及避免包涵體的形成；4）實驗流程簡便易行，省去了質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞破碎等繁瑣的操作步驟，而且產(chǎn)物便于后續(xù)的蛋白鑒定。

國外已有少量關(guān)于無細(xì)胞合成體系表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體的報道[31-32]，但我國應(yīng)用無細(xì)胞合成體系進(jìn)行蛋白表達(dá)的研究較少，而將其應(yīng)用于β2AR表達(dá)的研究報道尚屬空白。本研究從影響蛋白表達(dá)水平和活性較為重要的幾個因素，如密碼子優(yōu)化、表達(dá)條件篩選和蛋白純化等方面對無細(xì)胞體系制備β2AR的過程進(jìn)行了摸索。密碼子優(yōu)化時，CAI值是反映基因序列對宿主細(xì)胞適應(yīng)性最為重要的指標(biāo)，通常CAI越接近1，表明其越接近理想的高效表達(dá)狀態(tài)。本研究基因改造后，基因序列的CAI值由原來的0.70上升到改造后的0.96，說明改造后基因?qū)Υ竽c桿菌系統(tǒng)有良好適應(yīng)性。利用無細(xì)胞體系合成膜蛋白時，通常有3 種獲得可溶性蛋白的策略，分別是去污劑重懸、直接添加去污劑和添加磷脂。本研究采用直接向反應(yīng)體系添加非離子型去垢劑Brij35的方式，該抽提膜蛋白常用的去垢劑可使表達(dá)蛋白呈可溶狀態(tài)，有利于其活性保持。有關(guān)無細(xì)胞表達(dá)條件優(yōu)化的文獻(xiàn)報道極少。本研究就影響表達(dá)水平的Mg2+濃度進(jìn)行了篩選，以表達(dá)量為指標(biāo)，得到最適宜的Mg2+濃度為22 mmol/L，此時表達(dá)水平為1 250 μg/mL，高于Wang Jian等[28]用HEK293細(xì)胞和Cheng Guyue等[33]用桿狀病毒感染的sf9細(xì)胞的表達(dá)水平。但純化蛋白經(jīng)ELRA方法測定，與β激動劑的親和活性略低于以上兩種活細(xì)胞的相應(yīng)測定結(jié)果。因此，今后可以嘗試運用基于麥芽提取物或兔網(wǎng)織紅細(xì)胞等真核系統(tǒng)的無細(xì)胞合成體系表達(dá)β2AR蛋白，以求在提高表達(dá)水平的同時，使其活性更接近于天然受體蛋白。

4 結(jié) 論

依據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性，對前期克隆得到的豬β2AR cDNA基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，CAI值由改造前的0.70上升到改造后的0.96，GC含量由58%下降至46.17 %，更有利于在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)水平的提高。無細(xì)胞合成體系中最適宜的Mg2+濃度為22 mmol/L，此時的表達(dá)水平為1 250 μg/mL。SDS-PAGE分析可知，經(jīng)

MagneHis? Ni-Particles純化，在47 kDa附近出現(xiàn)清晰的特異性條帶，純度大于90%。ELRA活性鑒定結(jié)果顯示，純化后的重組受體蛋白可與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺的HRP標(biāo)記物發(fā)生特異性吸附。當(dāng)純化受體作1∶500稀釋時，OD值分別為0.976、0.836和0.728。上述結(jié)論為制備大量活性β2AR蛋白及建立基于受體的β激動劑快速檢測方法提供了理論依據(jù)。

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