β2腎上腺素受體基因的改造及在無細胞合成體系中的表達

王 健，劉 媛，王 瑋，劉 洋，韓正政，曲麗潔，楊立亭，王若敏

（1.河北北方學院食品安全研究中心，河北省農產品食品質量安全分析檢測重點實驗室，河北 張家口 075000；2.河北北方學院農林科技學院食品研究所，河北 張家口 075000）

β激動劑俗稱“瘦肉精”，食用含有其藥物殘留的畜產品極易引起人的急性中毒及心血管系統和神經系統的慢性病變[1]，因此我國早已嚴禁在飼料及飼料產品中將該類藥物作為動物促生長劑使用。目前，多種新型“瘦肉精”替代物的混合添加是監管執法的重點和難點，迫切需要能同時檢測多種該類違禁物的多殘留高通量檢測技術。

以大型分析儀器為基礎的確證檢測技術盡管可實現多種β激動劑的同時檢測[2-7]，但存在操作步驟繁瑣和儀器設備昂貴等缺點。相比而言，近年來興起的快速檢測技術融合了傳統免疫分析的特異性與新材料、新型信號識別體系的諸多優點，形成了一系列β激動劑快速檢測方法，如酶聯免疫吸附法[8-9]、膠體金免疫層析法[10-11]，量子點[12]、傳感器[13-14]和電化學[15-16]等，但它們大多以抗原抗體識別機制為基礎，檢測β激動劑的種類受到了很大限制，制約了方法的推廣應用。

受體分析技術是基于受體和配體特異性結合原理的一種類特異性識別快速檢測技術，可實現對某一類具有相似化學結構物質的多殘留檢測和未知物篩查[17]。國外于2005年后開始出現β2腎上腺素受體（β2adrenergic receptor，β2AR）應用于β激動劑檢測的報道[18-19]。但由于β2AR屬于具有7 個跨膜α螺旋結構的膜蛋白[20]，分離純化難度極大，而體外表達重組受體又存在產量、活性及純度等問題，因此制備大量β2AR活性蛋白成為了困擾該項技術實際應用的最大瓶頸。目前，有關β2AR表達的研究大多基于大腸桿菌[21]、酵母細胞[22]、桿狀病毒感染的昆蟲細胞[23]和哺乳動物細胞[24]等活細胞系統，而利用無細胞體系合成β2AR蛋白的報道極少。無細胞合成體系是以外源mRNA或DNA為模板，利用細胞裂解液和額外補充的底物和能量，在細胞外模擬細胞內蛋白合成與翻譯后修飾的蛋白合成體系。已開發的無細胞合成系統主要有兩類，一類是以利用大腸桿菌BL21（DE3）為代表的原核系統，另一類是利用麥芽提取物和兔網織紅細胞等的真核系統。除細胞抽提物制備、能量體系構成等問題外，無細胞反應的持續時間及遺傳模板的穩定性是影響整個體系蛋白合成效率的兩個關鍵因素[25]。國外學者發明且改進了連續交換式無細胞反應體系[26]，并通過調整模板自身結構[27]等方式使無細胞合成體系超過了基于細胞的體外表達水平。此外，在某些特殊蛋白質特別是活細胞難于表達的膜蛋白合成方面，無細胞合成體系顯示出良好的應用前景。

本研究從基因改造、表達條件優化和蛋白純化等多個方面探討不同因素對無細胞合成體系制備β2AR蛋白的影響規律，為實現β2AR的大量功能性表達及β激動劑受體檢測技術的研發提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

T4連接酶、限制性內切酶NdeI及XhoI、蛋白純化體系MagneHis? Ni-Particles 美國Promega公司；質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；pET-22b載體 美國Novagen公司；Brij35去污劑上海語燕生物技術有限公司；無細胞蛋白合成體系武漢金開瑞生物工程有限公司；辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記的羊抗鼠二抗、His鼠源單克隆抗體 美國Sigma公司；HRP標記的β激動劑北京勤邦生物技術有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

4800聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國AmpGene公司；Gel Doc2000凝膠成像分析系統 美國Bio-Rad公司；恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；THZ-03M2R恒溫空氣浴搖床上海博彩生物科技有限公司；DYCP-31BN、31CN型DNA電泳儀、DYCZ-24EN型蛋白電泳儀 北京六一儀器廠；Multiskan FC酶標儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 基因改造及合成

依據大腸桿菌密碼子的偏好性，利用密碼子優化網站（http∶//www.jcat.de/）對前期克隆獲得的豬β2AR cDNA基因序列（GenBank：KF023571.1）在不改變氨基酸序列的前提下進行改造，并分析其密碼子適應指數（codon adaptation index，CAI）和GC含量，以判斷其是否適應大腸桿菌表達。在改造后基因的5’端和3’端分別引入限制性內切酶NdeI和XhoI位點，便于后續表達質粒構建。改造后的β2AR基因由上海博亞生物技術有限公司合成，并連入pMD18-T載體，構建pMD18-T-β2AR克隆質粒，轉化Top10克隆菌株，利用氨芐青霉素抗性和藍白斑篩選陽性克隆，PCR及測序鑒定并保種。

1.3.2 重組表達質粒構建與鑒定

將pMD18-T-β2AR克隆質粒與表達載體pET-22b分別用限制性內切酶NdeI和XhoI進行雙酶切，然后切膠回收目的基因片段及載體片段，經T4 DNA連接酶在16 ℃下連接過夜，產物轉化大腸桿菌Top10菌株，采用LB-Amp平板篩選重組子，進行PCR鑒定，將初步鑒定為陽性的重組子送上海博亞生物技術有限公司測序，經驗證序列正確的重組表達質粒命名為pET-22b-β2AR。

1.3.3 無細胞體系合成β2AR蛋白

按照無細胞蛋白合成體系（武漢金開瑞生物工程有限公司提供）的操作要求，將體系中各試劑R1（大腸桿菌細胞抽提物純化所得的各種轉錄因子）、R2（細胞抽提物純化所得的蛋白質合成所需的各種酶系）、R3（氨基酸混合物）、R4（ATP、GTP、UTP、CTP等能量物質）、R5（RNA聚合酶）和R6（tRNA）依次加入到55 μL的反應杯中。為了避免不溶性蛋白沉淀的產生，還以終質量濃度為2 g/100 mL在體系中加入了非離子型去垢劑Brij35。最后在反應杯中加入1 μg重組表達質粒pET-22b-β2AR，置于30 ℃、180 r/min恒溫搖床中過夜反應，產物于-80 ℃冰箱保存備用。

為獲得最佳的表達水平，在K+濃度固定為300 mmol/L的前提下，對Mg2+濃度進行了優化研究。通過對反應產物的Western blot檢測，比較Mg2+濃度分別在14、16、18、20、22 mmol/L時蛋白表達水平的差異，以確定反應體系中最佳的Mg2+濃度。經小量表達優化表達條件后，進行大量表達。Western blot采用半干轉膜法，以His小鼠源單克隆抗體為一抗，HRP標記羊抗鼠抗體為二抗。

1.3.4 重組表達產物的純化

采用負載鎳離子的順磁性顆粒MagneHis? Ni-Particles對帶有His標簽的蛋白表達產物進行純化，具體操作流程按照所附說明書進行。取適量純化產物進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和活性鑒定。

1.3.5 純化產物的鑒定

采用SDS-PAGE方法檢測所獲得純化蛋白的純化效果。參考前期已建立的直接酶受體分析法（enzymelinked receptor assays，ELRA）測定該純化蛋白與3種β激動劑（鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇）HRP標記物的特異性結合程度，從而判定該純化蛋白對β激動劑的親和活性[28-29]。

2 結果與分析

2.1 改造后β2AR基因序列的分析與鑒定

根據大腸桿菌的偏好性，進行密碼子優化，并在編碼基因的5’端和3’端分別添加限制性內切酶NdeI（CATATG）和XhoI（CTCGAG），改造后基因及氨基酸序列如圖1所示。

經DNAman軟件分析，改造前后基因序列的一致性為74.86%。基因序列在大腸桿菌表達宿主中的CAI值由密碼子優化前的0.70上升到優化后的0.96，CAI值更接近于1，有利于提高在大腸桿菌系統中的表達水平。基因序列的GC含量由優化前的58%降至46.17%，可進一步延長mRNA的半衰期，有利于提高轉錄和翻譯效率。對pMD18-T-克隆質粒進行PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示，在1.3 kb左右出現特異性條帶，與預期片段大小相符，且測序結果與目的基因堿基完全一致。

圖1 改造后β2AR基因序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 Modif i ed gene and amino acid sequence of β2AR

圖2 pMD18-T-β2AR克隆質粒的PCR鑒定結果Fig.2 Identif i cation of pMD18-T-β2AR plasmid by PCR

2.2 重組表達質粒的鑒定

經藍白斑篩選，挑取陽性重組子進行PCR鑒定，如圖3所示，各陽性重組子在1.3 kb左右均出現了目的基因條帶，與預期大小相符，經測序鑒定與目的基因序列完全一致，將該重組表達質粒命名為pET-22b-β2AR。

圖3 重組表達質粒的PCR鑒定結果Fig.3 Identif i cation of recombinant expression plasmid by PCR

2.3 無細胞體系表達條件的優化

參照無細胞蛋白合成體系的操作要求，完成對β2AR的無細胞表達，對表達產物進行Western blot鑒定。在K+濃度為300 mmol/L的前提下，對影響表達水平的重要因素Mg2+濃度進行篩選。由Western blot結果（圖4）分析可知，不同Mg2+濃度下均在47 kDa左右出現特異性條帶，表明該體系成功表達目的蛋白。Mg2+濃度在14、16、18、20、22 mmol/L時表達水平分別為950、1 000、500、375、1 250 μg/mL，因此選定表達水平最高的22 mmol/L為最適宜的Mg2+濃度。

圖4 無細胞體系中Mg2＋濃度優化的Western blot鑒定Fig.4 Western blot analysis of CFPS system at different Mg2+ concentrations

2.4 純化蛋白的SDS-PAGE鑒定

圖5 純化蛋白的SDS-PAGE鑒定結果Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purif i ed protein

基于表達產物中含有來自pET-22b表達載體的His標簽，參考MagneHis? Ni-Particles的說明書對表達產物進行純化。純化蛋白采用SDS-PAGE方法進行鑒定，結果如圖5所示，在47 kDa附近出現清晰的特異性條帶，且周圍幾乎無雜蛋白，純度大于90%。

2.5 純化蛋白的β激動劑親和活性鑒定

按照筆者前期已建立的ELRA方法對純化蛋白進行β激動劑親和活性鑒定。如表1所示，純化所得受體蛋白在1∶500和1∶1 000稀釋時，均可與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺的HRP標記物發生特異性吸附。當受體蛋白作1∶500稀釋時，OD值分別為0.976、0.836和0.728，親和性由強到弱依次為HRP-克倫特羅＞HRP-沙丁胺醇＞HRP-萊克多巴胺。以上結果表明純化后的重組受體蛋白仍然保持了特異性識別β激動劑的生物活性。

表1 純化蛋白ELRA鑒定結果Table1 Identif i cation of the purif i ed protein by ELRA

3 討 論

目前，β2AR蛋白表達主要有原核系統和真核系統兩種方式。原核表達缺乏翻譯后修飾易發生錯誤折疊，表達蛋白多為包涵體不可溶形式。而真核系統表達的蛋白功能活性較之有所提高，但表達產量往往不能滿足研究需求。與以上活細胞表達系統相比，無細胞合成體系具有許多優點[30]：1）可表達對細胞有毒性的某些蛋白質，如膜蛋白等，避免其對宿主細胞的殺傷作用；2）反應周期短，產率較高；3）體系具有開放性特點，可通過添加外源物質，靈活調節反應條件以控制蛋白質的合成、翻譯、修飾加工及避免包涵體的形成；4）實驗流程簡便易行，省去了質粒轉化、細胞培養和細胞破碎等繁瑣的操作步驟，而且產物便于后續的蛋白鑒定。

國外已有少量關于無細胞合成體系表達G蛋白偶聯受體的報道[31-32]，但我國應用無細胞合成體系進行蛋白表達的研究較少，而將其應用于β2AR表達的研究報道尚屬空白。本研究從影響蛋白表達水平和活性較為重要的幾個因素，如密碼子優化、表達條件篩選和蛋白純化等方面對無細胞體系制備β2AR的過程進行了摸索。密碼子優化時，CAI值是反映基因序列對宿主細胞適應性最為重要的指標，通常CAI越接近1，表明其越接近理想的高效表達狀態。本研究基因改造后，基因序列的CAI值由原來的0.70上升到改造后的0.96，說明改造后基因對大腸桿菌系統有良好適應性。利用無細胞體系合成膜蛋白時，通常有3 種獲得可溶性蛋白的策略，分別是去污劑重懸、直接添加去污劑和添加磷脂。本研究采用直接向反應體系添加非離子型去垢劑Brij35的方式，該抽提膜蛋白常用的去垢劑可使表達蛋白呈可溶狀態，有利于其活性保持。有關無細胞表達條件優化的文獻報道極少。本研究就影響表達水平的Mg2+濃度進行了篩選，以表達量為指標，得到最適宜的Mg2+濃度為22 mmol/L，此時表達水平為1 250 μg/mL，高于Wang Jian等[28]用HEK293細胞和Cheng Guyue等[33]用桿狀病毒感染的sf9細胞的表達水平。但純化蛋白經ELRA方法測定，與β激動劑的親和活性略低于以上兩種活細胞的相應測定結果。因此，今后可以嘗試運用基于麥芽提取物或兔網織紅細胞等真核系統的無細胞合成體系表達β2AR蛋白，以求在提高表達水平的同時，使其活性更接近于天然受體蛋白。

4 結 論

依據大腸桿菌的密碼子偏好性，對前期克隆得到的豬β2AR cDNA基因序列進行密碼子優化，CAI值由改造前的0.70上升到改造后的0.96，GC含量由58%下降至46.17 %，更有利于在大腸桿菌系統中表達水平的提高。無細胞合成體系中最適宜的Mg2+濃度為22 mmol/L，此時的表達水平為1 250 μg/mL。SDS-PAGE分析可知，經

MagneHis? Ni-Particles純化，在47 kDa附近出現清晰的特異性條帶，純度大于90%。ELRA活性鑒定結果顯示，純化后的重組受體蛋白可與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺的HRP標記物發生特異性吸附。當純化受體作1∶500稀釋時，OD值分別為0.976、0.836和0.728。上述結論為制備大量活性β2AR蛋白及建立基于受體的β激動劑快速檢測方法提供了理論依據。

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