HPGFC雙柱串聯檢測右旋糖酐蔗糖酶催化產物及右旋糖酐聚合過程

黃雙霞，侯殿志,2，陳華磊，于 玥，陳 山,3,*

（1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；3.廣西蔗糖產業協同創新中心，廣西 南寧 530004）

右旋糖酐是蔗糖經右旋糖酐蔗糖酶催化產生的一種主鏈含α-（1,6）糖苷鍵大于90%的葡聚糖，并伴有以α-（1,2）、α-（1,3）或α-（1,4）糖苷鍵連接的分支[1-2]。右旋糖酐的用途與其聚合的葡聚糖分子數目密切相關，分子質量不同，其作用也不盡相同[3-5]。大分子質量的右旋糖酐（mw＞106Da）可用作色譜柱填充劑[6]；中等分子質量的右旋糖酐（105Da＜mw＜106Da）性質穩定、有良好的生物相容性和保濕性，可用作冰淇淋和果醬的增稠劑，化妝品和眼藥水的添加劑等[7]；低分子質量的右旋糖酐（104Da＜mw＜105Da）是優良的血漿代替品[8]；小分子質量的右旋糖酐（mw＜104Da）可用于右旋糖酐衍生品的制備[9-10]。

目前，多糖類物質的分子質量測定方法主要有滲透壓法、超速離心法、黏度法、高壓電泳法和光散射法等[11]。然而，這些方法普遍存在著操作麻煩且誤差大等問題。高效凝膠過濾色譜（high performance gel filtration chromatography，HPGFC）法以其快速、高分辨和重復性好的優點，在多糖及聚合物分子質量、分子質量分布及多聚分散性的測定方面得到廣泛應用[12]。HPGFC法測定多糖時，通常采用單柱分析或與質譜聯用[13-14]。而以酶法催化蔗糖制備右旋糖酐的體系中除了產物右旋糖酐外，還含有底物蔗糖及副產物果糖、葡萄糖等[15]。因此，建立一種能夠精密監測產物右旋糖酐分子質量變化、蔗糖、葡萄糖及果糖濃度等指標的方法對于后續的實驗非常重要。

工業上右旋糖酐的制備主要是通過腸膜狀明串珠菌（Leuconstoc mesenteriodes）分泌的右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖來完成的[16]。但由于發酵體系成分復雜，除含有大量菌體外，還含有其他營養成分，導致其合成機理難以實現有效的解析[17]。以分離純化得到的右旋糖酐蔗糖酶與蔗糖溶液直接接觸制備右旋糖酐，反應體系簡單，使得右旋糖酐合成機理的研究更具可行性[18-19]。目前，關于右旋糖酐的聚合機理還不明了，對該合成規律進行研究和探討有助于實現對不同分子質量右旋糖酐的定向制備[20]。此外，右旋糖酐合成機理方面的研究基本都是限制在同一反應體系中進行的，未采用干預措施，對于制備過程中是否存在抑制或者間歇合成的現象不能做出合理的解釋[21-23]。在此基礎上，本實驗通過構建右旋糖酐蔗糖酶耦合兩級膜對右旋糖酐的聚合過程進行探討和分析[24]，以期為酶法耦合膜分離技術定向制備特定分子質量右旋糖酐的實現提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸膜明串珠菌CICC-21724 中國工業微生物菌種保藏管理中心。

右旋糖酐標準品（色譜純） 美國Polymer Laboratories公司；果糖、蔗糖、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、醋酸鈉、冰醋酸、硫酸、氯化鈣、3,5-二硝基水楊酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；聚乙二醇6000（分析純） 廣東光華科技股份有限公司；牛肉膏、酵母膏（生物試劑）北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂（生物試劑）廣東環凱生物科技有限公司；蛋白胨（生物試劑）北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

1100 HPGFC儀（配有G1362A示差折光檢測器及GPC數據分析軟件） 美國Agilent公司；LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫用核子儀器有限公司；ZHJH-1115C垂直流超凈工作臺、ZHWY-211B全溫度恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；SHP-150生化培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；Avanti J-E多用途高效離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；Stat Fax 2100酶標儀 美國Awarendss公司；Barnstead Easy Pure LF超純水機 美瑞泰克科技（天津）有限公司；323E/D蠕動泵 斯派沙克集團公司；膜包（PXBO05A50、PXBO10A50、PXBO50A50、PXBO100C50） 默克密理博實驗室設備（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 右旋糖酐蔗糖酶的制備與分離純化

25 ℃斜面培養基中復活腸膜明串珠菌，24 h后進行平板劃線獲取單菌落，25 ℃、24 h恒溫培養；挑取單菌落至種子培養基中，25 ℃、150 r/min搖床培養；對數期接種至產酶培養基中（搖床培養條件同上），24 h后將發酵液4 ℃離心20 min，轉速為12 000 r/min，離心后的上清液即為右旋糖酐蔗糖粗酶液。采用課題組前期研究得到的雙水相法對右旋糖酐蔗糖粗酶液進行純化[25]。

1.3.2 右旋糖酐蔗糖酶的酶活測定

25 ℃催化單底物蔗糖1 min內生成1 μmol果糖所需的右旋糖酐蔗糖酶酶量，定義為一個酶活單位（U）。作為一種糖基轉移酶，右旋糖酐蔗糖酶能將催化蔗糖產生的D-吡喃葡萄糖基轉移到右旋糖酐鏈上，同時釋放出果糖分子。通常情況下，果糖含量采用3,5-二硝基水楊酸法進行測定，根據吸光度與還原糖含量的線性關系計算酶活[26]。

1.3.3 HPGFC單柱和雙柱的檢測對比實驗

對比單柱和雙柱對系列右旋糖酐標準品的分離效果以及對催化反應混合液中右旋糖酐、底物蔗糖及副產物果糖、葡萄糖的檢測效果。樣品的制備：在右旋糖酐蔗糖酶為0.2 U/mL，底物蔗糖濃度為0.2 mol/L，反應體系為400 mL條件下制備得到的催化產物經沸水浴滅活后，用超純水稀釋100 倍，過0.45 μm微孔膜，待測。

色譜柱：分別為KS-Guard+KS-801、KS-Guard+KS-805、KS-Guard+KS-805+KS-801。KS-Guard為保護柱。

色譜分離條件：安捷倫1100系統配示差檢測器，流動相為超純水，流速1.0 mL/min，檢測器溫度33 ℃，柱溫箱溫度65 ℃，進樣20 μL。

1.3.4 HPGFC雙柱串聯檢測各標準曲線的繪制

右旋糖酐標準溶液：將分子質量分別為5 900、22 800、47 300、112 000、212 000、404 000、778 000 Da的右旋糖酐標準品，配成10 mg/mL的溶液，經0.45 μm微孔膜過濾，進樣量20 μL，每個樣品平行操作3 次。

精確配制系列濃度蔗糖、葡萄糖和果糖溶液，在1.3.3節色譜分離條件下進樣檢測，繪制標準曲線，計算R2值，驗證HPGPC雙柱串聯是否可有效實現對樣品中蔗糖、葡萄和果糖的定量測定。

1.3.5 HPGFC雙柱串聯的精密性實驗

精確配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L和1.0 mmol/L系列濃度蔗糖溶液，將樣品的3 次峰面積進行平均，計算峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），驗證系統的精密度。

1.3.6 蔗糖轉化率、右旋糖酐產量和得率測定方法的構建

反應體系中底物蔗糖經右旋糖酐蔗糖酶作用，被等量的轉化為葡萄糖和果糖，絕大部分葡萄糖被用于合成目標產物右旋糖酐，果糖則被游離于反應體系中。因此，實驗以果糖峰開始下降的前一個取樣點作為聚合反應的終點。最后反應體系的終止樣中，含有未轉化的蔗糖、合成的右旋糖酐和生成的果糖、未來得及合成右旋糖酐的游離葡萄糖。

根據樣品中蔗糖、葡萄糖和果糖的峰面積分別代入標準曲線得到對應濃度，即可計算出樣品中剩余的蔗糖、葡萄糖和果糖的質量；最后按照質量守恒定律，通過公式（1）～（3）可以得出各指標：

1.3.7 右旋糖酐蔗糖酶添加量及蔗糖濃度對各指標的影響

右旋糖酐蔗糖酶添加量為0.2 U/mL時，探索0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L和1.0 mol/L系列蔗糖濃度對蔗糖轉化率、右旋糖酐產量和得率的影響規律；蔗糖濃度為0.1 mol/L時，探索0.1、0.2、0.4、0.6 U/mL和0.8 U/mL不同右旋糖酐蔗糖酶添加量對蔗糖轉化率、右旋糖酐產量和得率的變化規律。反應體系均為400 mL，30 h進行取樣，樣品處理按1.3.3節方法。

1.3.8 右旋糖酐蔗糖酶耦合兩級膜對右旋糖酐聚合過程

1.3.8.1 酶法耦合兩級膜裝置的示意圖及其運行過程

圖1 酶法耦合兩級膜過程裝置圖Fig.1 Schematic diagram of the process of enzymatic treatment coupled with two-stage membrane separation

如圖1所示，將膜裝置按實驗流程圖進行連接，然后將經高壓滅菌過的蔗糖溶液進行膜的預處理，使連接管路內預充滿本次實驗的蔗糖溶液。然后將配制好的蔗糖酶溶液放進料液桶中（進行磁力攪拌和水浴恒溫25 ℃），分別啟動一級膜和二級膜的蠕動泵（大約在0.5 h左右啟動二級膜蠕動泵），通過調節2 個蠕動泵的轉速來平衡膜裝置的流速，使整個系統處于平衡循環狀態。

1.3.8.2 右旋糖酐聚合過程

為了更加細致準確地分析酶法耦合兩級膜干預條件下右旋糖酐的聚合過程，本實驗對一級膜料液桶和二級膜料液桶分別進行定時取樣檢測，以監測反應過程中目標產物分子質量的走勢。從右旋糖酐蔗糖酶和底物蔗糖溶液接觸時開始計時，在兩者反應0、2、4、6、8、10、20、30、40 h和50 h分別進行取樣，樣品處理按1.3.3節方法。以蔗糖（濃度0.1～1.0 mol/L）為反應底物，加入右旋糖酐蔗糖酶（濃度0.1～0.8 U/mL），耦合膜過程，構建終體積為400 mL的反應體系。

2 結果與分析

2.1 HPGFC單柱和雙柱串聯對不同分子質量右旋糖酐標準品的檢測效果

由圖2可以看出，在單柱KS-801檢測情況下，7 種不同分子質量的右旋糖酐標準品的出峰時間十分接近，色譜峰幾乎重疊和覆蓋在一起，很難完全分離鑒定。各右旋糖酐樣品的分子質量由于均超過了柱子的最大分離范圍，根據尺寸排阻的分離原理，它們無法進入凝膠孔隙而直接被流動相超純水淋洗出來。相比而言，KS-805柱由于排阻極限達到5×105，可以實現7 種分子質量右旋糖酐的完全分離。在KS-805+KS-801雙柱串聯的情況下，7 種不同分子質量的右旋糖酐分離效果很理想，各個色譜峰之間不存在重疊和覆蓋的問題，且相比于KS-805，各個色譜峰分布也相對比較分散。在此檢測條件下，樣品先進入KS-805柱內，根據分子質量大小，依次得到有效分離；進入KS-801柱后，直接被洗脫出。KS-805+KS-801雙柱串聯可以很好地實現對右旋糖酐各個分子質量的分離和鑒定，且效果較好。

圖2 單柱和雙柱條件下不同分子質量右旋糖酐標準品的出峰情況Fig.2 Chromatographic peaks for different molecular masses of dextran under single-column and double-column separation conditions

2.2 HPGFC單柱和雙柱串聯對催化反應混合液的檢測效果

圖3 單柱和雙柱檢測條件下催化產物的出峰情況Fig.3 Chromatographic peaks of catalytic reaction products under single-column and double-column separation conditions

從圖3可以看出，KS-801單柱可有效分離和鑒定小分子右旋糖酐、葡萄糖和果糖，但由2.1節結果可知KS-801單柱無法對大分子右旋糖酐的分子質量進行準確的計算和分析；KS-805單柱雖然排阻限較大，但是由于不具備配位體功能，無法分離和鑒定出小分子葡萄糖和果糖，且產物右旋糖酐的峰出現拖尾，連接到蔗糖峰，這對于右旋糖酐分子質量的計算和分析會產生不良的影響。

在KS-805+KS-801雙柱串聯使用的情況下，根據尺寸排阻與配位體交換原理，右旋糖酐和其他小分子糖類（葡萄糖、果糖等）得到了有效的分離和鑒定；右旋糖酐峰與其他糖類峰之間也沒有出現拖尾和連接的現象。另外，由于葡萄糖基被鏈接到右旋糖酐蔗糖酶上進行右旋糖酐的合成，故在圖3中，葡萄糖峰很低。由以上分析可見，KS-805+KS-801雙柱串聯對樣品中的大小分子糖類均可實現有效的檢測。

2.3 HPGFC雙柱串聯檢測右旋糖酐分子質量校正曲線的繪制

圖4 右旋糖酐分子質量校正曲線Fig.4 Calibration cure of dextran

根據檢測數據，繪制得到的右旋糖酐分子質量校正曲線如圖4所示。其擬合方程為：Y=13.619 9-1.548 08X+0.115 34X2-0.003 79X3。Y為右旋糖酐分子質量的對數，X為洗脫體積，R2為0.999 8，表明KS-805和KS-801雙柱串聯使用能夠很好地實現對產物中各個分子質量右旋糖酐的測定。

2.4 HPGFC雙柱串聯檢測蔗糖、葡萄糖和果糖標準曲線的擬合方程

圖5 不同濃度蔗糖的HPGFC洗脫疊加圖Fig.5 Overlapping chromatograms for different concentrations of sucrose

表1 蔗糖、葡萄糖及果糖標準曲線的擬合方程Table1 Fitting equations of standard curves for sucrose,glucose and fructose

從圖5可以看出，不同濃度的蔗糖出峰時間穩定，隨著蔗糖濃度的增大，峰面積增大，也表明檢測方法具有較好的穩定性。由表1可知蔗糖、葡萄糖及果糖標準曲線的擬合方程，三者R2均大于0.998，線性相關性比較好。根據上述分析可知，HPGFC雙柱串聯可以很好地實現對反應體系中蔗糖、葡萄糖及果糖濃度的定量跟蹤檢測。

2.5 HPGFC雙柱串聯檢測的精密性結果

表2 不同濃度蔗糖的峰面積均值及RSDTable2 Mean values of peak area and RSD for different concentrations of sucros

由表2可知，不同蔗糖濃度3 次峰面積均值的RSD較小（低于1%），表明KS-805+KS-801雙柱串聯檢測具有較高的精密性，實驗結果具有可靠和準確性。

2.6 右旋糖酐蔗糖酶添加量及蔗糖濃度對蔗糖轉化率、右旋糖酐產量和得率的影響

根據1.3.6節中公式（1）～（3）計算得到各反應體系系列的蔗糖轉化率、右旋糖酐產量及右旋糖酐得率，如表3所示。

同一右旋糖酐蔗糖酶添加量體系各反應系列，隨著蔗糖底物濃度的升高，蔗糖轉化率呈下降趨勢，右旋糖酐產量不斷增加，右旋糖酐得率也不斷上升。在右旋糖酐蔗糖酶添加量一定的情況下，當蔗糖底物濃度和右旋糖酐蔗糖酶添加量都充足時，蔗糖轉化率自然會較高，但是隨著蔗糖濃度的提升，右旋糖酐蔗糖酶量不足，高濃度的蔗糖又會對右旋糖酐蔗糖酶表現出抑制作用，進而導致蔗糖轉化率降低。另外一方面，盡管蔗糖濃度升高出現其轉化率降低的現象，但是相對低濃度的蔗糖底物，其合成產物右旋糖酐的產量仍會持續增加。右旋糖酐得率自然也會因為2 種指標的改變不斷上升。

表3 不同右旋糖酐蔗糖酶添加量及蔗糖底物濃度條件下蔗糖轉化率、右旋糖酐產量及得率的變化Table3 Effect of enzyme dosage and sucrose concentration on the conversion of sucrose and dextran yield

同一蔗糖底物濃度反應體系，整體上則表現為隨著右旋糖酐蔗糖酶添加量的增加，蔗糖轉化率和右旋糖酐產量相應上升，但右旋糖酐得率出現先上升后下降的現象。蔗糖底物濃度一定時，右旋糖酐蔗糖酶添加量的不斷增加使得合成反應持續進行且相對比較完全，進而蔗糖轉化率和右旋糖酐產量會不斷上升。右旋糖酐得率表現出先上升后略微下降的現象有可能是因為底物蔗糖有限，導致被右旋糖酐蔗糖酶水解成的葡萄糖基有限，即便全部的葡萄糖基被用于右旋糖酐的合成，其得率相對于大量被轉化的蔗糖仍然相對較小。進而當右旋糖酐蔗糖酶添加量超過一定限度時（0.4 U/mL），右旋糖酐得率出現下降的現象。

2.7 右旋糖酐聚合過程分析

在檢測方法建立的基礎上，本實驗通過構建右旋糖酐蔗糖酶耦合兩級膜干預右旋糖酐的聚合過程，對其合成機理進行更深一步的研究。為更加細致準確地分析其聚合過程，本實驗分別在一級膜料液桶和二級膜料液桶進行定時取樣，監測右旋糖酐的分子質量變化。

2.7.1 蔗糖濃度對一級膜料液中產物右旋糖酐分子質量的影響

在右旋糖酐蔗糖酶添加量為0.2 U/mL不變的情況下，改變反應體系的底物濃度（0.2～1.0 mol/L），一級膜料液桶中產物右旋糖酐分子質量變化如圖6。從整體上看，同一右旋糖酐蔗糖酶添加酶量反應體系，不同濃度蔗糖底物溶液中聚合成的產物右旋糖酐分子質量隨著反應時間的延長并沒有表現出大幅度波動的現象（從小分子慢慢形成大分子），而是在檢測的初始階段即為百萬級別分子質量的右旋糖酐。5 個反應系列的產物右旋糖酐分子質量變化趨勢在一級膜料液桶中整體趨于一致，在反應的前10 h呈現出很小幅度的上升趨勢，之后產物右旋糖酐分子質量幾乎不再改變，趨于平衡。從各個反應系列的變化曲線可以看出，產物右旋糖酐的分子質量隨著蔗糖底物溶液濃度的升高出現小幅度下降，但重均分子質量還都是維持在106Da以上。同一右旋糖酐蔗糖酶添加量反應體系，產物右旋糖酐的分子質量與蔗糖底物的濃度呈負相關關系。Kim等[27]在右旋糖酐蔗糖酶添加量一定的條件下，改變蔗糖底物濃度（0.1～4.0 mol/L），研究終產物右旋糖酐分子質量的變化情況，結果表明，隨著蔗糖底物濃度的升高，產物右旋糖酐分子質量逐漸降低，這也與本實驗的研究結果相一致。另外，有研究表明[28-29]，高濃度的蔗糖溶液會致使右旋糖酐蔗糖酶的活性位點構象發生改變，進而造成聚合反應受到一定程度的抑制，反應稍微傾向于合成低聚糖，結果產物右旋糖酐分子質量相對較小。

圖6 0.2 U/mL反應體系中一級膜料液桶中右旋糖酐分子質量變化Fig.6 Changes in molecular mass of dextran during reaction catalyzed by 0.2 U/mL dextransucrase in the fi rst stage of membrane treatment

2.7.2 蔗糖濃度對二級膜料液中產物右旋糖酐分子質量的影響

以0.2 U/mL和1.0 mol/L反應體系為代表，得到的一級膜料液桶和二級膜料液桶中起始樣和終止樣的色譜疊加對比如圖7所示。

通過對0.2 U/mL反應體系各系列設置時間段的樣品進行檢測分析表明，在二級膜料液桶中均未有目標產物右旋糖酐的出現。由于樣品數量較多，但為了更好地研究證實右旋糖酐的聚合機理，以0.2 U/mL、1.0 mol/L為代表得到起始點2 h和終止點30 h兩個時間點的一級膜料液桶和二級膜料液桶中樣品的色譜疊加圖。對比圖7的2 個相同時間點的一級膜料液桶和二級膜料液桶中樣品色譜疊加圖，可以明顯的看出在一級膜料液桶樣品色譜疊加圖中有大分子質量右旋糖酐的峰顯現，而二級膜料液桶樣品色譜疊加圖中除蔗糖、游離葡萄糖、果糖外，并沒有右旋糖酐的峰出現；這一現象很好地證明了右旋糖酐的聚合可能不是一個從小到大慢慢聚合、不斷釋放的過程；而是右旋糖酐鏈在酶活性位點上不斷聚合葡萄糖基，當達到一定分子質量水平（mw＞106Da）時才從酶活性位點脫落的過程。在單酶法耦合兩級膜的作用下，如果右旋糖酐的聚合是一個從小到大且不斷從酶活性位點上脫落的過程，則在兩級膜的作用下，按照檢測條件要求，應該會相應地檢測到中小分子質量的右旋糖酐；但是根據目前的實驗結果，在各個系列樣品中均未檢測到產物右旋糖酐，而只有小分子的糖類（蔗糖、葡萄糖、果糖）。同時從圖7也可以看出，隨著反應時間的延長，底物蔗糖由于被消耗，其峰值明顯下降較多；水解蔗糖產生的葡萄糖也被用于右旋糖酐的合成，峰值明顯小于果糖；此外，隨著反應的持續進行也使得果糖峰不斷增大。

圖7 0.2 U/mL、1.0 mol/L反應體系中反應起始樣和終止樣的疊加譜圖Fig.7 Overlapping chromatograms of reaction products at 2 and 30 h from 0.2 U/mL dextransucrase and 1.0 mol/L surocse in two stage of membrane treatment

2.7.3 右旋糖酐蔗糖酶添加量對一級膜料液中產物右旋糖酐分子質量的影響

圖8 0.1 mol/L反應體系中一級膜料液桶中右旋糖酐分子質量變化Fig.8 Changes in molecular nass of dextran during catalysis of 0.1 mol/L sucrose the fi rst stage of membrane treatment

在蔗糖底物濃度為0.1 mol/L不變的情況，改變反應體系的右旋糖酐蔗糖酶添加量（0.1～0.8 U/mL），一級膜料液桶中產物右旋糖酐分子質量的變化如圖8所示。從產物右旋糖酐分子質量變化趨勢曲線可以看出，除了0.8 U/mL反應系列分子質量低于106Da之外，其他系列產物右旋糖酐的分子質量水平普遍都處于106Da以上。從開始檢測到有大分子右旋糖酐生成，到反應終止，整個反應體系各個系列的產物右旋糖酐分子質量在整個聚合反應過程并沒有出現大幅度的波動現象。結合圖6和圖8兩個不同反應體系各系列的產物右旋糖酐分子質量的變化情況，可以從一個側面間接證明，在單酶法作用底物蔗糖制備右旋糖酐時，整個聚合過程應該是葡萄糖基被不斷的被轉移到右旋糖酐鏈上，直至達到一定分子質量水平（106Da左右）才從右旋糖酐蔗糖酶上脫落。另外，在蔗糖底物濃度相同的情況，不同的右旋糖酐蔗糖酶添加量對產物右旋糖酐分子質量變化的影響并不是很大，基本都維持在百萬級別以上；隨著右旋糖酐蔗糖酶添加量的增加，產物右旋糖酐的分子質量整體上呈下降趨勢，這與Falconer等[30]的研究結果相一致。同一蔗糖底物濃度反應體系，產物右旋糖酐的分子質量與右旋糖酐蔗糖酶添加量呈反相關關系。右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖產生的D-葡萄糖基被不斷的轉移到右旋糖酐鏈上，共價結合到右旋糖酐蔗糖酶的活性位點上；右旋糖酐蔗糖酶添加量的減少導致反應體系溶液中的酶分子也相應減少，進而用于共價鏈接右旋糖酐鏈的酶活性位點也隨著減少；因此相同濃度的蔗糖底物反應溶液，右旋糖蔗糖酶添加量少的反應體系中酶活性位點也相對較少，右旋糖酐鏈附著在較少數量的活性位點上不斷聚合葡萄糖基，形成較高分子質量的右旋糖酐。

2.7.4 右旋糖酐蔗糖酶添加量對二級膜料液中產物右旋糖酐分子質量的影響

圖9 0.1 U/mL、0.1 mol/L反應體系中反應起始樣和終止樣的疊加譜圖Fig.9 Overlapping chromatograms of reaction products at 2 and 30 h from 0.1 U/mL dextransucrase and 0.1 mol/L surocse

結合一級膜料液桶中反應的起點和終點，以0.1 U/mL和0.1 mol/L反應體系為代表，得到一級膜料液桶和二級膜料液桶中起始樣和終止樣的色譜疊加對比圖如圖9所示。同一取樣時間點，一級膜料液桶樣品色譜疊加圖中出現大分子質量右旋糖酐，而二級膜料液桶樣品色譜疊加圖中只有蔗糖、葡萄糖、果糖小分子糖類，未有目標產物右旋糖酐。這與2.7.2節的研究結果相一致，右旋糖酐的聚合應該是在酶活性上葡萄糖基不斷聚合，直至右旋糖酐鏈達到一定分子質量才脫落的過程，且分子質量水平幾乎都處于百萬級別以上（mw＞106Da）。另外，相比于同一右旋糖酐蔗糖酶添加量反應體系的其他系列，0.1 U/mL系列右旋糖酐蔗糖酶添加量較少，目標產物右旋糖酐的產量也較低，相應的溶液黏度也比較稀，但是也并未在二級膜中檢測到與一級膜標記截留量有出入的右旋糖酐分子，這說明超濾膜對此反應體系具有很好的截留性。從圖9也可以看出，隨著反應的進行，一級膜料液桶和二級膜料液桶樣品中蔗糖底物被逐漸消耗，葡萄糖由于被用于聚合右旋糖酐，其峰值明顯小于果糖峰。

3 結 論

通過分別采用單柱KS-801、KS-805及雙柱串聯對不同分子質量的右旋糖酐標準品和催化反應混合液進行檢測發現，KS-805+KS-801雙柱串聯使用可以很好地實現對樣品中不同分子質量的右旋糖酐、蔗糖、葡萄糖和果糖的有效檢測；在初步建立雙柱串聯檢測方法的基礎上，繪制得到的右旋糖酐分子質量校正曲線、蔗糖、葡萄糖和果糖標準曲線的相關性較高，表明此法可以對樣品中右旋糖酐分子質量實現精確的測定，且可以定量跟蹤檢測催化反應混合液中蔗糖、葡萄糖和果糖的濃度變化。最后通過對不同濃度蔗糖溶液的定量檢測，3次峰面積均值的相對標準偏差都小于1%且出峰情況穩定，表明該檢測方法和系統具有較高的精密性和可靠性。

此外，在檢測方法得到建立的基礎上，通過構建右旋糖酐蔗糖酶耦合兩級膜探究了右旋糖酐的聚合過程。通過跟蹤檢測不同蔗糖濃度和右旋糖酐蔗糖酶添加量條件下，一級膜和二級膜料液桶中右旋糖酐分子質量的變化，間接證實了右旋糖酐的聚合機理是右旋糖酐分子鏈在右旋糖酐蔗糖酶活性位點上不斷聚合葡萄糖基，直至達到一定的分子質量（mw＞106Da）才脫落，而不是一個從小到大、慢慢聚合、不斷脫落的過程。

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