響應面試驗優化超聲系統中玉米醇溶蛋白-葡聚糖糖基化及其性質分析

董艷嬌，張 浩，趙城彬，許秀影，王文舉，劉景圣,*

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118；2.吉林工程技術師范學院食品工程學院，吉林 長春，138000；3.白城師范學院化學學院，吉林 白城 137000）

玉米醇溶蛋白是玉米中主要的食品級蛋白質，屬于醇溶谷蛋白類，主要來自玉米濕法制備淀粉過程中的主要副產品玉米黃粉，具有無毒、綠色環保、可食用、生物可降解和用途廣等優點[1]。玉米醇溶蛋白具有50%以上的非極性氨基酸，及缺乏堿性和酸性氨基酸，使其具有較高的疏水性[2-3]，導致其難溶于水，而溶于乙醇溶液和堿性溶液（pH值不小于11.5）中[4-5]，限制了其在食品工業中的應用。近年來采用糖基化反應修飾蛋白質已受到國內外學者的廣泛關注，將改性的蛋白質作為添料應用于食品配方中是一種極具潛力的方法。蛋白質與多糖通過糖基化反應形成的復合物能夠顯著提高蛋白質的溶解性、乳化性、熱穩定性、凝膠性、抗氧化和抗菌活性等功能性質[6]。此外，Yang Zhenhuang等[7]研究發現糖基化反應能夠顯著降低蛋白質的致敏性，這與致敏蛋白的結構變化有關，由于反應中不需任何催化劑，可以作為新型功能性材料應用于食品工業、醫藥科學和生物材料等領域[8]。

近年來研究發現，超聲波技術在提高糖基化反應效率、改善共價交聯產物功能性質方面也發揮著重要作用。超聲波通過空穴效應產生的壓力、剪切力、渦流、動態攪拌以及熱效應等[9]加速糖基化反應的進行，其產物的抗氧化能力和清除自由基能力均高于普通濕熱法制備的糖基化產物，是一種高效的糖基化反應方法[10-11]。目前，關于超聲輔助糖基化反應提高蛋白質功能性質的研究主要集中在大豆蛋白、乳清蛋白和花生蛋白與葡萄糖、麥芽糖、麥芽糊精等的小分子糖復合[12-13]，且容易產生Maillard高級階段的不溶產物，不利于蛋白質改性。然而，關于玉米醇溶蛋白與分子質量較大的葡聚糖的糖基化反應工藝研究及其產物結構和功能性的研究鮮有報道。本實驗采用超聲輔助濕熱法制備玉米醇溶蛋白-葡聚糖糖基化產物，對反應工藝進行響應面試驗優化，同時采用傅里葉紅外光譜技術對玉米醇溶蛋白糖基化產物結構進行觀察分析和功能性測定，為開發高效的玉米醇溶蛋白與大分子糖的糖基化改性方法提供理論支持和技術參考，提升玉米醇溶蛋白附加值，拓寬其在食品行業中的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白（純度≥98%） 百靈威科技有限公司；葡聚糖（70 kDa）、鄰苯二甲醛（1,2-phthalic dicarboxaldehyde，OPA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、β-巰基乙醇（均為色譜級）美國Sigma公司；牛血清蛋白 國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍試劑盒 北京鼎國生物技術有限責任公司；四硼酸鈉（分析級） 上海化學試劑公司；不同pH值（3～11）緩沖溶液 天津市天大化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

HH-4電熱恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；IKA RCT basic電動磁力攪拌器 上海艾研生物科技有限公司；FD-1B-50冷凍干燥機 上海比朗生物科技有限公司；X-30R高速冷凍離心機 丹麥Allegra公司；Spectramax 190全波長酶標儀 美國Molecular Devices公司；VERTEX70傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker公司；K9860全自動凱式定氮儀 濟南海能儀器有限公司；AL204電子分析天平 梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白-葡聚糖糖基化產物制備

根據Yin Baoru等[14]方法稍作改動，準確稱取一定量的玉米醇溶蛋白溶于磷酸緩沖溶液（pH 12）配制蛋白質量分數為2%，與不同質量濃度的葡聚糖溶液（pH 12）混合，磁力攪拌2 h，4 ℃靜止24 h，使溶液充分混和。將混合溶液置于超聲波反應器中，80 ℃反應一定時間。反應結束后將pH值調至7.0，4 000×g離心20 min，上清液透析24 h，之后冷凍干燥，得到接枝產物。

1.3.2 接枝度測定

接枝度的測定方法以光譜分析為基礎，采用OPA試劑進行游離氨基含量的測定來表示[15]。OPA溶液配制：將80 mg的OPA溶解在2 mL甲醇中，并與50 mL 0.1 mol/L的四硼酸鈉緩沖液（pH 9.7）、5 mL質量分數20% SDS以及200 μL的β-巰基乙醇混合，充分混勻后用蒸餾水定溶至100 mL。將100 μL的復合體系樣品溶液（2 mg/mL）與2 mL的OPA試劑在35 ℃水浴反應2 min，然后采用全波長酶標儀測定波長340 nm處的吸光度，以天然玉米醇溶蛋白作為對照樣，樣品接枝度按公式（1）計算：

式中：Ab為對照樣的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.3.3 單因素試驗設計

1.3.3.1 超聲時間對玉米醇溶蛋白-葡聚糖接枝度的影響

按1.3.1節的方法，將糖質量濃度為0.01 g/mL玉米醇溶蛋白-葡聚糖混合液在超聲功率為200 W的條件下分別反應20、30、40、50、60 min，測定超聲時間對糖基化產物接枝度的影響，每個試驗水平重復3 次取其平均值。

1.3.3.2 超聲功率對玉米醇溶蛋白-葡聚糖接枝度的影響

按1.3.1節的方法，將糖質量濃度為0.01 g/mL玉米醇溶蛋白-葡聚糖混合液分別在超聲功率為100、200、300、400、500 W條件下反應40 min，測定超聲功率對糖基化產物接枝度的影響，每個試驗水平重復3 次取其平均值。

1.3.3.3 糖質量濃度對玉米醇溶蛋白-葡聚糖接枝度的影響

按1.3.1節的方法，分別配制糖質量濃度為0.002 5、0.005、0.01、0.02、0.04 g/mL玉米醇溶蛋白-葡聚糖混合液，溶液在超聲功率為200 W條件下各反應40 min，測定不同糖質量濃度對糖基化產物接枝度的影響，每個試驗水平重復3 次取其平均值。

1.3.4 響應面試驗優化玉米醇溶蛋白-葡聚糖糖基化工藝條件

根據單因素試驗結果，選取超聲時間、超聲功率、糖質量濃度作為自變量，根據Box-Behnken試驗設計建立3因素3水平試驗，以接枝度為響應值，進行響應面試驗優化確定最佳糖基化工藝條件。試驗設計如表1所示。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table1 Factors and levels used in response surface analysis

1.3.5 傅里葉紅外光譜分析

根據Zhang Xuan等[16]的方法。取2 mg的待測樣品，加入40 mg的溴化鉀，用瑪瑙研缽研成均勻粉末使其充分混合，置于壓片機中壓成薄片，將制備得到的薄片置于紅外光譜儀中進行測定。測定條件：光譜掃描范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，波數精度為0.01 cm-1，掃描次數32 次。

1.3.6 溶解性的測定

將樣品溶于不同pH值（3～11）緩沖液中，配成蛋白質量濃度為2 mg/mL的溶液，然后將不同pH值的蛋白溶液在室溫條件下12 000 r/min離心30 min。以牛血清蛋白為標準物，采用考馬斯亮藍法[17]測定上清液中可溶性蛋白質含量。總蛋白質含量采用微量凱氏定氮法測定。蛋白質溶解度以上清液中可溶性蛋白質含量占總蛋白質含量的百分比表示。不同pH值緩沖溶液：pH 3，0.05 mol/L檸檬酸鹽緩沖液；pH 4～5，0.05 mol/L醋酸鹽緩沖液；pH 6～8，0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液；pH 9～11，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液。必要時采用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液調節到所需的pH值。

1.3.7 乳化性和乳化穩定性測定

參照Cheng Haiying等[18]方法，略有改進。取12 mL 0.01 g/mL待測樣品溶液（樣品蛋白溶于0.2 mol/L pH 7.5磷酸緩沖液中），加入4 mL大豆油（金龍魚），在1 200 r/min，室溫條件下高速均質2 min，立即在距離底部0.5 cm處取樣。以0.001 g/mL SDS（pH 7.5）稀釋50 倍，波長500 nm處測定吸光度，以SDS溶液為空白對照。乳化性和乳化穩定性按公式（2）、（3）計算：

式中：T=2.303；N為稀釋倍數；C為乳狀液形成前溶液中蛋白質的質量濃度/（g/mL）；φ為乳狀液中油相體積分數（0.25）；A0為0 min吸光度；A30為30 min吸光度。

1.3.8 起泡能力和泡沫穩定性測定

根據劉瑾[19]方法略有改動。將一定濃度的玉米醇溶蛋白溶液100 mL置于500 mL量筒中，使用高速均質機（12 000 r/min）均質40 s，連續3 次累計2 min，記錄均質后液面高度為V0，靜止30 min后記錄液面高度，記為V30。起泡能力和泡沫穩定性按公式（4）和（5）計算：

1.4 統計分析

每個實驗至少重復3 次，結果表示為 ±s。采用Origin 8.5軟件作圖。數據統計分析和差異顯著性（P＜0.05）使用SPSS V 17.0軟件分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

圖1 各單因素對玉米醇溶蛋白糖基化反應接枝度的影響Fig.1 Effects of reaction conditions on DG of conjugates

由圖1a可知，隨著超聲時間的延長，玉米醇溶蛋白糖基化產物的接枝度逐漸增大，當超聲時間達到50 min時，接枝度達到最大，之后隨時間延長逐漸下降。這可能是由于適當的超聲波處的空化作用和熱效應使玉米醇溶蛋白的空間構象使結構變得更加松散，蛋白分子發生展開，使內部的氨基酸暴露出來[20]，接枝位點增多，促進與糖的碰撞機率，利于糖基化反應的進行，進而導致接枝度增加；但是過長的超聲時間會引起蛋白展開的肽鏈重新聚集，反應的游離氨基位點被掩蓋，接枝度降低。

由圖1b可知，隨著超聲功率的增加，玉米醇溶蛋白糖基化產物的接枝度逐漸增大，當超聲功率達到300 W時，接枝度趨于平緩。這可能是由于適當的超聲功率會加速蛋白分子展開，使內部的氨基酸暴露更快，接枝位點增多，促進與糖的碰撞機率，利于糖基化反應的進行，進而導致接枝度增加；另外，大功率的超聲波作用會引起蛋白展開的肽鏈重新聚集，反應的游離氨基位點被掩蓋，導致接枝度降低。考慮節能性選擇超聲功率為300 W。

由圖1c可知，隨著糖質量濃度增加，糖基化產物的接枝度逐漸增加，當糖質量濃度為0.02 g/mL時，玉米醇溶蛋白-葡聚糖的接枝度顯著增加（P＜0.05）；而當糖質量濃度高于0.02 g/mL時，接枝度增加的相對緩慢。這可能是因為增加糖質量濃度，使更多的葡聚糖與蛋白質的賴氨酸基團發生反應，導致接枝度的增加。然而，隨著糖質量濃度的進一步增加，反應氨基數量的大幅降低，使糖基化反應達到飽和狀態[21]，導致接枝度的增加趨于平緩。

2.2 響應面試驗優化結果

根據單因素試驗結果，選擇超聲時間、超聲功率、糖質量濃度為Box-Behnken設計的3 個因素，優化超聲反應條件的響應面試驗設計及結果見表2。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表3數據進行二次多元回歸擬合，得到的響應值回歸模型函數為：Y=18.36-0.48X1-0.64X2-0.020X3-0.15X1X2-0.24X1X3-0.25X2X3-1.86-1.48-1.24。

表2 Box-Behnken響應面試驗設計及結果Table2 Box-Behnken design with experimental results

表3 回歸模型方差分析Table3 Analysis of variance for regression model

由表3方差分析可知，模型P值小于0.000 1，說明模型極顯著，模型的失擬項不顯著，回歸決定系數R2為0.996 3，調整決定系數為0.991 4，表明此方程的擬合性較好，可靠性較高。根據結果進行分析得出：一次項X1和X2極顯著，二次項X1X3和X2X3顯著，、和極顯著。說明此模型擬合程度較好，用該模型對超聲波輔助玉米醇溶蛋白糖基化反應的工藝進行優化是可行的。超聲波反應條件中各因素交互作用的響應面及等高線見圖2。

由圖2可以看出，超聲時間與超聲功率交互作用圖雖接近為橢圓形，但P值為0.138 8大于0.05，交互作用未達到顯著水平。超聲時間與糖質量濃度、超聲功率與糖質量濃度的交互作用圖為橢圓，交互作用顯著。數據分析表明，回歸模型存在最大值，糖基化最佳工藝條件為：超聲時間50.15 min、超聲功率277.78 W、糖質量濃度0.025 6 g/mL，理論最大接枝度為18.42%。為實際操作的可行性，選擇以下條件進行實驗：超聲時間50.15 min、超聲功率300 W、糖質量濃度0.025 g/mL。在此條件下糖基化的平均接枝度為18.28%，達到預測值的99.24%。

圖2 各因素交互作用對接枝度影響的響應面及等高線圖Fig.2 3D response surface and contour plots showing the interactive effect of reaction conditions on DG of conjugates

2.3 超聲波輔助玉米醇溶蛋白糖基化產物結構與性質

2.3.1 傅里葉變換紅外光譜分析

圖3 玉米醇溶蛋白及糖基化產物紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of zein and glycosylated zein

傅里葉變換紅外光譜是一個有效測定蛋白-糖接枝產物結構的方法[22]。由圖3可以看出，與天然玉米醇溶蛋白相比，對于2 種復合物來說，在1 070 cm-1和1 404 cm-1出現明顯的吸收峰是由于C—O和C—N伸縮振動引起的[23]，這表明葡聚糖分子與玉米醇溶蛋白分子連接在一起，發生了糖基化反應，引入了相應的功能基團，導致蛋白側鏈振動，并產生了相應的吸收峰。在3 340 cm-1處出現較寬的吸收峰，是由O—H伸縮振動引起的[24]，這表明玉米醇溶蛋白發生糖基化反應后，葡聚糖分子以共價鍵形式接入蛋白分子中，使—OH的數量增多。2 種復合物在2 800～3 000 cm-1之間（2 927 cm-1）的吸收變強，這是由C—H[sp3]反對稱伸縮振動產生的[25]，進一步證實了葡聚糖分子與蛋白形成了共價復合物。在1 542 cm-1（酰胺II）和1 658 cm-1（酰胺I）吸收峰稍有增強，這是由于N—H平面彎曲、C—N伸縮振動和C—O伸縮振動引起的[26]，這是由于隨著糖基化反應的進行，產物中糖胺化合物、Schiff堿和吡嗪類化合物含量會升高，因此，此處吸收峰強度升高。由上述分析可以明顯的證明，玉米醇溶蛋白與葡聚糖分子之間發生了復雜的交聯和聚合作用。

2.3.2 接枝度比較

水浴加熱和超聲處理玉米醇溶蛋白與葡聚糖的糖基化程度不同，相同條件下水浴加熱處理的玉米醇溶蛋白和葡聚糖復合物的接枝度為（10.13±0.66）%，超聲處理的玉米醇溶蛋白和葡聚糖復合物的接枝度為（18.28±1.03）%，與水浴加熱處理相比，接枝度提高了44.58%，這可能是由于超聲波的空化作用和熱效應促進糖基化反應效率[20]。

2.3.3 溶解性的影響

圖4 玉米醇溶蛋白和糖基化物的溶解特性Fig.4 Solubility prof i le of native zein and glycosylated zein in the pH range of 3–11

由圖4可以看出，在pH 3～11的范圍內，天然玉米醇溶蛋白溶解性較低，pH 6時溶解度最低，推斷可能為玉米醇溶蛋白的等電點，這一結果與楊光等[27]一致。復合物的溶解性均顯著高于天然玉米醇溶蛋白（P＜0.05），且等電點沒發生變化，其中超聲波處理糖基化反應產物的溶解性最大，說明葡聚糖能夠顯著提高玉米醇溶蛋白的溶解性。這可能是由于糖基化反應中蛋白與糖的共價結合引入了親水基團，增加蛋白的親水能力，從而增加蛋白的溶解性[28]。超聲處理可使蛋白質的部分結構展開，蛋白分子柔性更好，結構更松散，增加與糖分子共價結合糖基化位點，引入更多的糖分子中親水性羥基，進而增加了蛋白質與水分子之間的親和能力，同時能夠掩埋蛋白質的疏水性殘基和降低蛋白質之間由靜電相互作用引起的聚集，從而使體系溶解性增加[29]。這與Wang Xiaojie等[30]利用美拉德反應將氨基糖導入蛋白質中，從而改善了玉米醇溶蛋白的溶解性結果一致。

2.3.4 乳化性和起泡性的影響

表4 玉米醇溶蛋白乳化性和起泡性Table4 Emulsifying properties and foaming properties of zein and glycosylated zein

由表4可以看出，與天然玉米醇溶蛋白相比，糖基化的蛋白乳化性顯著增加（P＜0.05），超聲系統中糖基化產物最高。這可能是由于超聲波產生的瞬時空化效應和熱效應使玉米醇溶蛋白結構展開，暴露更多的被包裹的疏水基團，增大了蛋白表面疏水性，進而提高了蛋白質的乳化性。同時，經過糖基化修飾的蛋白側鏈引入了糖的親水基團，一方面使聚合物的親水性增加，另一方面由于大分子糖鏈的空間位阻效應，使產物形成了比較致密的界面膜，能夠有效地阻止油相的相互聚集，從而提高蛋白質的乳化穩定性[31]。由表4還可以看出，與天然玉米醇溶蛋白相比，糖基化的蛋白起泡能力和泡沫穩定性均顯著增加（P＜0.05），這是因為蛋白質溶解度的大小是影響泡沫穩定性的首要條件，溶解性高，起泡性越好。玉米醇溶蛋白與葡聚糖糖基化反應后，親水性的糖鏈的共價結合到蛋白質中，產物中引入了羥基，羥基的數量增多，蛋白質的溶解性和蛋白分子間的靜電作用力增強，泡沫能力也得到改善；另外起泡能力和泡沫穩定性的提高也可能與超聲的空化效應及熱效應有關，超聲處理可使蛋白質的部分結構展開，蛋白分子成為柔性更好，結構更松散，形變能力更強的產物，可能增加起泡能力和泡沫穩定性[32-33]。

3 結 論

利用響應面法確定玉米醇溶蛋白糖基化最佳工藝條件為：超聲時間50.15 min、超聲功率300 W、糖質量濃度為0.025 g/mL。在此條件下糖基化的平均接枝度為18.28%，普通水浴加熱條件下接枝度為10.13%，接枝度提高了44.58%。對糖基化后的玉米醇溶蛋白的結構和功能性測定得出，傅里葉紅外光譜證明，玉米醇溶蛋白與葡聚糖通過共價鍵結合形成聚合物。通過功能性的測定發現，超聲系統中的糖基化產物的溶解性、乳化性、乳化穩定性、起泡能力和泡沫穩定性顯著提高，說明超聲波技術能夠促進糖基化反應，使玉米醇溶蛋白的功能特性顯著改善，提高了糖基化反應效率，拓寬了玉米醇溶蛋白的加工利用領域。

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