豬乙型腦炎病毒SCYA201201株感染小鼠后突破血腦屏障能力研究

柴春霞，王 僑，賴雅蘭，徐伊璇，文心田，曹三杰，黃小波，文翼平，趙 勤，伍 銳

(四川農業大學 動物醫學院 豬病研究中心，四川 成都 611130)

豬乙型腦炎病毒SCYA201201株感染小鼠后突破血腦屏障能力研究

柴春霞，王 僑，賴雅蘭，徐伊璇，文心田，曹三杰，黃小波，文翼平，趙 勤，伍 銳*

(四川農業大學 動物醫學院 豬病研究中心，四川 成都 611130)

摘 要：將豬乙型腦炎病毒SCYA201201株(F122代次，弱毒株)腦內接種小鼠，評估該病毒株對小鼠的致病性。通過腹腔接種小鼠，分別在接種后6、12、18、24h觀察小鼠腦部病理變化，同時利用熒光定量PCR方法檢測其血液、腦組織E基因拷貝數，探究該毒株突破小鼠血腦屏障的能力，從而評估SCYA201201株(F122代次)作為弱毒活疫苗的潛力。結果顯示，SCYA201201株(F122代次)高度弱化，對乳鼠的腦內半數致死量(LD50)僅為4×105PFU·40μL-1。該毒株腹腔接種24h內，小鼠腦部未出現病理變化，且熒光定量PCR檢測為陰性，表明該毒株不能突破小鼠的血腦屏障，具有很高的安全性。

關鍵詞：豬乙型腦炎病毒；半數致死量；熒光定量PCR；血腦屏障

日本乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)是一種經蚊蟲傳播的人畜共患傳染病，病原體是日本乙型腦炎病毒(JEV)。JEV屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)，包括衣殼蛋白C、膜蛋白M、囊膜蛋白E等3個結構蛋白和NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5等7個非結構蛋白[1]。豬是JEV主要傳染源和最重要的自然增殖動物。豬感染JEV雖然不會引起較高的死亡率，但是會引起種豬的繁殖障礙，如母豬發生流產，產死胎、弱仔以及木乃伊胎，公豬發生急性睪丸炎或者不育[2]，給養豬業帶來嚴重損失。

JEV的E基因與病毒吸附穿入致病和機體宿主的免疫應答作用密切相關，能刺激機體產生中和抗體和血凝抑制抗體，為免疫原性蛋白，前膜蛋白prM和E蛋白具有免疫原性，E蛋白在決定病毒致病力上起著重要作用。根據E基因核苷酸序列的差異，可以將JEV分為5個基因型：即基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型[3]。基因Ⅰ型主要來源于泰國北部、柬埔寨、韓國；基因Ⅱ型來自泰國南部、印度尼西亞、馬來西亞、澳大利亞；基因Ⅲ型主要分離于亞洲溫帶地區，如日本、中國、印度等地；基因Ⅳ型主要存在于印度尼西亞；基因Ⅴ型出現得少，在馬來西亞、中國和韓國分離得到。在我國，JEV的基因型主要是Ⅰ型和Ⅲ型[4]，1979年我國研究人員分離出Ⅰ型JEV毒株，在我國遼寧[5]等多地出現，數量逐漸增多，危害也越來越大。在我國應用廣泛的是WH1株的鼠腦滅活苗和SA14-14-2株減毒活疫苗，這2個毒株均屬于基因Ⅲ型。目前我國尚無商品化的基因Ⅰ型疫苗，對基因Ⅰ型疫苗的研究刻不容緩。

血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)由腦微管內皮細胞及其細胞間的緊密連接、完整的肌膜、周細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞腳圍成的神經膠質膜構成[6]。乙腦病毒主要通過破壞內皮細胞間緊密連接[7]穿越血腦屏障入侵腦部，破壞神經細胞與腦內微環境，引起中樞神經系統感染，因此，檢測乙型腦炎病毒早期突破血腦屏障的能力，可作為乙型腦炎減毒活疫苗安全性評估的有效手段。本實驗選用BHK-21細胞上的連續傳代培養、毒力致弱的F122代次乙腦病毒SCYA201201株接種小鼠，測定小鼠腦內半數致死量(LD50)，熒光定量PCR檢測腹腔接種24h內F122代病毒在血液、腦組織中的病毒含量與腦組織病理變化，對該毒株的安全性進行基礎評估，為后續將SCYA201201株繼續致弱制備弱毒疫苗提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 毒株、細胞與實驗動物

豬源乙型腦炎病毒(SCYA201201株)，于2012年8月從四川雅安某豬場流產胎兒腦組織中分離鑒定，由四川農業大學動物醫學院豬病研究中心保存。F122代次乙腦病毒，由SCYA201201株乙腦病毒在BHK-21細胞上連續傳代致弱得到。BHK-21細胞由四川農業大學動物醫學院豬病研究中心凍存。3周齡SPF昆明小鼠購自四川成都達碩有限公司。

1.2 主要試劑

RNAsimple Total RNA Kit、Real Master Mix(SYBR Green)FP202均購自天根生化科技(北京)有限公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 乙腦病毒滴度的測定

將生長良好的BHK-21細胞按常規消化后接種于6孔板中，每孔2mL。在接種病毒液之前將病毒原液用DMEM營養液按照10倍梯度稀釋至合適稀釋倍數。將稀釋好不同梯度的病毒液接種于6孔板中，每孔0.5mL，并設置1孔為對照組，37℃孵育，1.5h后吸取孵育液，每孔加入2mL的甲基纖維素維持液，37℃培養4～6d，待細胞出現病變后，吸取維持液，加入5%甲醛固定15min，再加入1%結晶紫染色15～20min，數出空斑數量，計算出病毒的滴度(PFU·mL-1)。

1.4 乳鼠LD50測定

將F122代病毒液10倍梯度稀釋后，取10-1～10-5病毒稀釋液接種小鼠(平均體質量7～8g)，每個稀釋度接種5只，每只腦內注射40μL，棄去2d內死亡的小鼠，連續觀察14d，記錄小鼠死亡情況并以Reed-Muench法計算LD50。

1.5 小鼠腹腔接種及樣品采集

將3周齡SPF昆明雌鼠隨機分成2組，每組12只，其中1組作為對照。SCYA201201株接種組按3.58 LD50腹腔接種，對照組接種PBS。接種后6、12、18、24h分別取小鼠血液及腦組織，觀察腦部病理變化。

1.6 熒光定量PCR E基因拷貝數的測定

將取好的腦組織和血液按照天根生化科技(北京)有限公司生產的RNA simple Total RNA Kit說明書提取總RNA，反轉錄參照TaKaRa PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒的說明進行。標準曲線參照Yuan等[8]文章所示乙腦病毒檢測方法：將實驗室已制備好的E基因標準品陽性模板進行10倍梯度稀釋，以濃度梯度起始模板數的對數值為X軸，相應的循環數(Ct)值為Y軸作回歸曲線，由Mini opticon Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad，USA)得出定量PCR的動力學曲線和標準曲線的表達式。熒光定量反應體系參照Real Master Mix(SYBR Green)FP202試劑盒說明。E基因引物序列：F，5′-CATTGGAGCCACTTGGGTG-3′；R，5′-TTGTGGGCTTCTCCTGTCG-3′。反應體系20μL:RealMasterMix/SYBR solution 9.0μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，cDNA 1.0μL，ddH2O 8.4μL。反應程序：95℃ 2min；95℃ 15s，57℃ 20s，68℃ 20s，79℃ 10s，39個循環；65～95℃溶解循環。

2 結果與分析

2.1 乙腦病毒滴度的測定

將F121代乙腦病毒[感染復數(MOI)0.01]接種于鋪滿單層的BHK-21細胞中，24h細胞沒有明顯變化，到48h細胞由梭形變圓縮，大面積脫落堆積(圖1)，并收毒。收取的F122代乙腦病毒液在BHK-21細胞上作空斑實驗(圖2)，培養至3.5d，細胞出現變形裂解，結晶紫染色后，計數蝕斑數目，測定F122代病毒的滴度為4.2×107PFU·mL-1。

A，BHK-21陰性對照；B，接毒48h細胞病變。A，Control of BHK-21;B，Cytopathies of injection at 48h.圖1 豬乙型腦炎F122代次毒株接種BHK-21的細胞病變Fig.1 Cytopathies of BHK-21 inoculated with F122 generation of porcine JEV

A，F122代次蝕班；B，空白對照。A，Plaque of F122 strain;B，Negative control.圖2 豬乙型腦炎病毒F122代次毒株接種BHK-21細胞后的蝕斑觀察Fig.2 Results of plaque after inoculation with F122 generation of porcine JEV in BHK-21

2.2 小鼠LD50的測定

將病毒10倍梯度稀釋腦內接種后：在10-1稀釋倍數下小鼠在第5天開始出現麻痹、四肢抽搐，并開始死亡，第6天5只全部死亡；在10-2稀釋倍數下小鼠在第5天出現四肢間歇性抽搐癥狀，在第6天死亡4只，第7天死亡1只；在10-3稀釋倍數下小鼠第6天開始出現麻痹等神經癥狀，第7天死亡4只；在10-4稀釋倍數下小鼠也出現了抽搐等癥狀，在第7天、第8天各死亡1只；在10-5稀釋倍數下小鼠沒有出現死亡。通過統計死亡數據，按照Reed-Muench法計算出F122代乙腦病毒對乳鼠的半數致死量(LD50)為10-3.7·40μL-1(4×105PFU·40μL-1)。

2.3 腦部組織病變觀察結果

將F122代乙腦病毒按3.58 LD50腹腔接種小鼠后，分別在6、12、18、24h獲取小鼠腦部，并記錄其顱骨外膜及腦組織的病理眼觀變化。如圖3所示，有顱骨外膜的小鼠從接種病毒后6～24h內與PBS對照組并無明顯差異。

將腦部顱骨去掉、腦組織完全暴露后，觀察發現，組織形態與PBS對照組基本一致(圖4)，并無感染乙腦病毒的非化膿性腦炎病理變化，如腦軟膜模糊、腦實質充滿斑點狀出血點或腦灰質出血。

A，6h；B，12h；C，18h；D，24h.圖3 顱骨外膜病理變化Fig.3 Histopathological changes of skull epicardium

2.4 標準曲線建立

以JEVE基因標準品陽性模板進行熒光定量RT-PCR反應，由Miniopticon Detection System得到標準曲線：Y=-3.292X+39.1，拷貝數為3.2×10xcopies·μL-1，擬合度r2為0.995。

2.5 熒光定量PCR檢測乙腦病毒E基因拷貝數

根據讀取到的不同時間點血液和腦組織病毒cDNA模板Ct值和標準曲線公式計算得到模板的初始拷貝數值，再轉換為初始模板拷貝數的平均值對數值(lg copies)，結果如圖5所示。SCYA201201組在6h腦組織和血液中病毒含量均高于PBS組，12h腦組織病毒含量較6h顯著(P<0.05)下降，并低于PBS組，血液中病毒含量在6～12h變化并不明顯，18～24h腦組織病毒含量緩慢下降，且仍低于PBS組，血液中病毒含量在18h最低，低于PBS組，24h腦組織和血液中病毒含量基本與PBS組持平。總體來看，F122代乙腦病毒在感染小鼠早期沒有突破血腦屏障。

圖5 病毒感染小鼠后不同時間腦組織(A)和血液(B)中的病毒拷貝數Fig.5 Virus copies of E gene in brain(A) and blood(B) at different time

3 討論

乙腦病毒會嚴重影響人畜中樞神經系統，并引起腦炎癥狀。人或動物被感染后，病毒侵入體內并迅速進入血流，在外周血管中增殖，隨后進入到神經外組織，特別是其網狀內皮細胞和血管內皮細胞中。病毒經脊液或內皮細胞、吞噬細胞、淋巴細胞感染或血源路線進入中樞系統(CNS)[9]。當病毒感染的劑量大或具有極高毒力時，病毒可能突破血腦屏障(BBB)，侵入中樞神經系統，并在腦組織內大量增殖，產生病變，引起神經癥狀。因此，對乙腦病毒在早期突破血腦屏障作探究很有必要。通過分析熒光定量PCR結果，并結合腦組織和血液的共同分析可知，病毒首先進入血液后，在外周血管中迅速增殖，所以在6～12h血液中含量較高，而病毒也可能隨著血流暫時性地進入大腦血管中，因此在6h測得腦組織中病毒含量亦較高，但隨著時間推移，機體對此會做出免疫反應，而且F122代次的病毒是在BHK-21細胞傳代毒力致弱的，病毒會被逐步消滅，所以最終無法在24h內透過內皮細胞間隙造成血腦屏障損傷。結合腦部解剖結果，也沒有出現中樞神經系統中的典型病變：大腦皮質、中腦、腦橋和基底核的病變；神經細胞變性與壞死，形成軟化灶；血管充血，形成血管套；腦實質斑點狀的出血點等[10]。先前研究表明，乙腦病毒與西尼羅病毒、蜱傳腦炎病毒一樣，中樞系統的感染時間晚于血腦屏障發生功能障礙時間[11-13]，本研究結果也間接驗證了這一結論。

我國早期成功研制的日本乙型腦炎病毒的鼠腦和雞胚疫苗，由于鼠腦疫苗中含有動物腦組織成分，不良反應較重，少數人群可引起過敏性休克、變態反應性腦脊髓炎等[14-15]，后逐步被淘汰。20世紀80年代后期，我國成功研制的乙腦減毒活疫苗采用了具有良好免疫原性的減毒株SA14-14-2[15-16]，通過原代地鼠腎細胞培養制備的活疫苗。有報道顯示，當前用于人的唯一乙腦弱毒活疫苗JEV-L株，接種疫苗的40%會有過敏反應，2%出現神經反應，2.5%出現了嚴重的不良反應[17]。疫苗的安全性是能否廣泛應用的關鍵，對于減毒活疫苗，毒株的毒力、安全性、免疫原性等都是研究的重點。針對目前我國乙腦病毒基因型流行情況，以及疫苗研發進展，以基因Ⅰ型的豬源SCYA201201株作為研究主體，將該毒株細胞傳代致弱，目前已經傳到F122代次，已獲得其病毒細胞滴度，并使用昆明鼠測得乳鼠LD50的指標。據文獻報道，昆明品系的小鼠是黃病毒科病毒研究的模型動物[18]，可為新的減毒活疫苗做準備。JEV在BHK-21細胞的連續傳代培養，使病毒在BHK-21細胞的適應性增強，病毒的細胞滴度明顯提高，病毒細胞毒的滴度從F16代病毒的104.71PFU·mL-1提高到F122代病毒的107PFU·mL-1，乳鼠的半數致死量LD50也從F16代10-4.22·40μL-1增加到F122代10-3.7·40μL-1。病毒的滴度與半數致死量的大小成正相關，從上述數據可以發現，SCYA201201株毒力是逐漸減弱的，結合熒光定量PCR結果，F122代乙腦病毒無法在24h內突破血腦屏障，并且腦部沒有眼觀病理變化。因此，本研究可為SCYA201201株作為疫苗應用的安全性研究做一定鋪墊，也為后續將其開發成弱毒活疫苗奠定了研究基礎。

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Abilitytobreakthroughblood-brainbarrierofporcineJapaneseencephalitisvirusSCYA201021strainafterinfectioninmice

CHAI Chunxia，WANG Qiao，LAI Yalan，XU Yixuan，WEN Xintian，CAO Sanjie，HUANG Xiaobo，WEN Yiping，ZHAO Qin，WU Rui*

(ResearchCenterofSwineDisease，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

Abstract:In the present study，SPF Kuming mice were inoculated with SCYA201021 strain(F122 generation，attenuated strain of porcine Japanese encephalitis virus) by intracerebral injection in order to evaluate its potential value as the attenuated live vaccine，and its ability to break through the blood-brain barrier in mice.After infection in mice，pathological changes in mice brain were observed，and theEgene copes were measured by fluorescent quantitative PCR in the blood and brain at 6，12，18，24h after inoculation，respectively.The results indicated that the virulence of SCYA201021 strain(F122 generation) was significantly weakened as the half lethal does(LD50) in suckling mice brain was only 4×105PFU·40μL-1.Moreover，the mice did not show pathological changes in the brain during the 24h after intraperitoneal injection，and the quantitative PCR results were negative，indicating that the SCYA201021 strain could not break through the blood-brain barrier in mice and the SCYA201021 strain had high safety.

Key words:porcine Japanese encephalitis virus;half lethal does;fluorescent quantitative PCR;blood-brain barrier

中圖分類號：S855.3

A

文章編號：1004-1524(2018)06-0926-06

收稿日期：2017-10-30

基金項目：國家重點研發計劃(2016YFD0500403)

作者簡介：柴春霞(1993—)，女，內蒙古呼和浩特人，碩士，主要從事豬乙型腦炎病毒研究。E-mail:chaichunxia_ccx@126.com

，伍銳，E-mail:wurui1977@163.com

10.3969/j.issn.1004-1524.2018.06.06

(責任編輯盧福莊)