粉防己堿對胃癌耐藥細胞ZNF139、MDR1及GST-π mRNA的影響

張旭

(內江市第一人民醫院 消化內科，四川 內江 641000)

化療是目前治療胃癌的重要手段之一，其可抑制胃癌細胞的微轉移，殺死殘存的胃癌細胞，進而降低術后局部復發和遠處轉移；但是胃癌細胞對化療藥物產生的多藥耐藥(multi-drug resistance，MDR)卻是影響化療效果的主要因素，其可導致多藥聯合化療的總有效率下降50%左右，嚴重影響預后[1-2]。因此，研究胃癌細胞MDR的機制并從中尋找逆轉的辦法進而提高化療效果，已成為目前廣大醫師關注的重點和難點。有研究[3]表明，鋅指蛋白139(ZNF139)、多藥耐藥基因1(MDR1)及谷胱甘肽S轉移酶-π(GST-π)mRNA均在胃癌細胞MDR過程中發揮著重要作用，而粉防己堿(TET)不但具有良好的抗腫瘤效果，還對多種腫瘤的MDR均有明顯的逆轉作用[4]。為此，本研究對胃癌細胞SGC7901以及胃癌耐阿霉素細胞SGC7901/ADR經TET處理前后的ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白表達水平進行了檢測分析，旨在為探討TET對胃癌MDR的作用提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞株SGC7901和胃癌耐阿霉素(ADR)細胞株SGC7901/ADR均購自中國科學院上海細胞研究所。

1.2 試劑與儀器

胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI 1640培養基購自美國GIBCO公司，Trizol提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測試劑盒均購自美國Promega公司，TET購自美國Sigma公司，PCR儀為美國應用生物系統公司生產(型號為7900FS)，恒溫培養箱為北京永光明儀器公司生產,GIS圖像處理系統由上海天能科技公司提供。

1.3 細胞培養

利用含10%新胎牛血清的RPMI 1640培養基培養SGC79O1細胞，以含0.4 mg·L-1ADR的培養基培養SGC7901/ADR細胞，以維持其耐藥表型。

取對數期生長的GC7901和SGC7901/ADR部分細胞，利用RPMI 1640培養基稀釋成濃度為8×104ml-1的單細胞懸液，再各取100l接種于96孔培養板，培養24 h。取部分SGC7901/ADR細胞懸液，吸出培養液后再加入含2.0g·ml-1TET的培養基[5]，每孔終體積100l，繼續培養48 h。

1.4 RT-PCR檢測

分別收集SGC7901、SGC 7901/ADR和經TET處理后的細胞懸液，利用Trizol試劑盒提取組織RNA，加入逆轉錄試劑盒后將RNA逆轉錄為cDNA，利用RT-PCR檢測試劑盒進行RT-PCR反應，檢測ZNF139、MDR1、GST-π基因的mRNA表達水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 蛋白印跡法檢測

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 兩種細胞ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白表達

SGC7901/ADR細胞ZNF139、MDR1、GST-π mRNA相對表達量明顯高于SGC7901細胞(P<0.05)，見表1；SGC7901/ADR細胞ZNF139、MDR1、GST-π蛋白相對表達量明顯高于SGC7901細胞(P<0.05)，見表2。

細 胞mRNA相對表達量ZNF139MDR1GST-πSGC79010.421±0.0840.408±0.0910.387±0.090SGC7901/ADR1.011±0.1230.972±0.0830.980±0.086t值-12.526-14.481-15.064P值<0.05<0.05<0.05

細 胞蛋白相對表達量ZNF139MDR1GST-πSGC79010.394±0.0640.408±0.0710.410±0.082SGC7901/ADR0.722±0.0961.104±0.1010.972±0.103t值-8.99-17.827-13.499P值<0.05<0.05<0.05

2.2 TET處理前后SGC7901/ADR細胞表達情況

TET處理后，SGC7901/ADR細胞ZNF139、MDR1、GST-π mRNA相對表達量均較處理前明顯降低(P<0.05，表3)，SGC7901/ADR細胞ZNF139、MDR1、GST-π蛋白相對表達量也明顯低于處理前(P<0.05，表4)。

3 討 論

3.1 研究背景

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，目前臨床上多采用化療方式治療，雖然能取得一定的效果，但長期應用藥物導致的MDR性會影響化療的效果，進而影響預后[6]。MDR是臨床上常見的耐藥方式，主要是指腫瘤對化療藥物的適應性改變，尤其是對其他抗腫瘤藥物產生交叉耐藥性，從而嚴重影響化療的效果[7-8]。研究[9]表明，針對MDR的腫瘤細胞，一味地增加藥物劑量非但不能提高療效,還可能會產生更大的毒副作用。目前臨床上仍沒有能有效逆轉MDR的藥物，而研究MDR的發作機制并尋求逆轉的藥物已成為目前腫瘤化療研究的重點和難點。

時 間mRNA相對表達量ZNF139MDR1GST-π處理前1.011±0.1230.972±0.0830.980±0.086處理后0.124±0.0640.194±0.0620.187±0.070t值20.2323.74822.615P值<0.05<0.05<0.05

時 間蛋白相對表達量ZNF139MDR1GST-π處理前0.722±0.0961.104±0.1010.972±0.103處理后0.106±0.0110.411±0.0810.604±0.075t值20.15916.9279.133P值<0.05<0.05<0.05

3.2 ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白表達與MDR的關系

研究[10-11]表明，MDR的發生機制較為復雜，一般認為是多種因素共同作用的結果，目前已確定的發生機制主要包括與耐藥相關的一些藥物轉運蛋白如P170糖蛋白(P-gp)、鋅指蛋白139(ZNF139)、多藥耐藥相關蛋白-1(MDR-1)等的高表達以及與細胞質/核有關的因素如谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、谷胱甘肽(GSH)、凋亡抑制等，而腫瘤細胞某些生化特征改變等都與耐藥性產生機制有關。研究[11]表明，ZNF蛋白含有特殊的鋅指結構域，具有轉錄調控功能，參與了腫瘤細胞增殖、凋亡以及MDR過程；而MDR-1是MDR相關蛋白的重要成員之一，其也被認為是MDR機制中最重要的機制之一[12]。GST-π是GST的亞型之一，在許多腫瘤組織和細胞中過度表達，并能調節信號途徑，促進腫瘤的發生和發展過程，也被認為是腫瘤化療產生耐藥性的主要因素之一[13]。本研究通過對胃癌細胞SGC7901以及胃癌細胞SGC7901/ADR的ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白表達進行檢測發現，SGC7901/ADR細胞ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白相對表達量明顯高于SGC7901細胞(P<0.05)，提示ZNF139、MDR1、GST-π基因均與MDR的機制有密切關系，其相關蛋白的高度表達可能參與了MDR的發生和發展過程。

3.3 TET對胃癌細胞MDR的影響

TET是目前研究認為具有MDR逆轉作用的新藥之一，主要從中藥粉防己的根塊中提取得到，活性成分為雙芐基異喹啉類生物堿。研究[14-15]表明，TET不但具有良好的抗腫瘤作用，還對多種腫瘤的MDR有一定的逆轉作用，但其具體機制目前尚不完全清楚，一般認為TET能激活內源性凋亡途徑并抑制Erkl/2和Aktl/2通路，進而逆轉MDR。

本研究對胃癌耐ADR細胞SGC7901/ADR加入了2.0g·ml-1TET進行處理，并對處理前后的ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白表達水平進行了檢測分析，結果表明，TET處理后SGC7901/ADR細胞ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白相對表達量明顯低于處理前(P<0.05)，提示TET能明顯下調胃癌耐藥細胞ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白表達水平，進而在逆轉胃癌MDR特性方面發揮著重要作用。但本研究限于研究樣本的不足，對TET下調ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白表達水平的機制以及能否將TET作為逆轉胃癌MDR的藥物尚待進一步研究。

綜上所述，TET能下調胃癌耐藥細胞ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白表達水平，從而在逆轉胃癌MDR特性方面發揮重要作用。

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