牦牛肉中穩定同位素指紋特征及影響因素

郭波莉，魏益民，魏帥，孫倩倩，張磊，師振強

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牦牛肉中穩定同位素指紋特征及影響因素

郭波莉，魏益民，魏帥，孫倩倩，張磊，師振強

（中國農業科學院農產品加工研究所/農業部農產品質量安全收貯運管控重點實驗室，北京 100193）

【目的】分析牦牛肉中穩定碳、氮、氫同位素組成，以及它們受地域、牧草和飲水的影響，為其產地溯源及真偽鑒別提供技術支撐?！痉椒ā繌那嗪Ｊ『１薄⒑Ｄ?、玉樹3個不同地域采集牦牛肉、牧草及水樣品，利用GPS定位采樣地的經度、緯度及海拔高度，利用元素-穩定同位素比率質譜儀（EA-IRMS）分析樣品中穩定碳、氮、氫同位素比率?！窘Y果】牦牛脫脂肌肉、粗脂肪中的δ13C平均值分別為（-23.99±0.25）‰和（-28.77±0.50）‰；脫脂肌肉中的δ15N和δ2H平均值分別為（4.04±0.91）‰和（-107.99±11.08）‰。牦牛肉中δ13C、δ15N值主要受其食用的牧草影響，地域對牦牛肉中的δ13C值也有一定的影響，即牦牛肉中δ13C值有隨海拔的增加而增加的趨勢。青海省海北、海南、玉樹3個地區牧草和水中的δ2H值均有極顯著差異，牧草中δ2H值由高到低的順序依次為海南＞海北＞玉樹，水中δ2H值由高到低的順序依次為海北＞海南＞玉樹。牦牛肌肉中δ2H值由高到低的順序依次為海南＞海北＞玉樹，與牧草中δ2H值的地域變化順序一致。說明牦牛肉中的δ2H值與牧草、飲水密切相關，均有隨海拔升高而降低的趨勢，且牧草對牦牛組織中氫同位素組成的影響可能大于水的影響，但這還需要進一步研究證實?！窘Y論】牦牛肉中穩定同位素指紋與高海拔地區的牧草、飲水、地形密切相關，具有獨特的指紋特征。

牦牛肉；穩定同位素指紋；牧草；飲水

0 引言

【研究意義】牦牛生長在高海拔、無污染的高寒地區，食用天然的牧草，飲用天然的礦泉水，其肉質細嫩、味道鮮美，含有豐富的蛋白質、氨基酸，以及胡蘿卜素、鈣、磷等微量元素，具有極高的營養價值[1]。但一些不法商販常受經濟利益驅動，以其他牛肉冒充牦牛肉，欺騙消費者，影響牦牛肉的品牌形象，因此開發一套穩定、科學的鑒別技術對其進行監管和保護具有重要意義。【前人研究進展】穩定同位素指紋是用于農產品產地、飼喂信息鑒別的有效技術之一。目前此項技術已用于葡萄酒[2-3]、蜂蜜[4]、奶酪[5]、牛奶[6-7]、咖啡[8-9]、谷物（如小麥、大米等）[10-13]、橄欖油[14-15]、牛肉[16-22]、羊肉[23-25]、雞肉[26]和豬肉[27]等各種農產品產地溯源與鑒別研究?！颈狙芯壳腥朦c】國內專家研究發現不同產地來源的牦牛肉穩定碳、氮、氫同位素組成有顯著差異，利用穩定同位素可以區分不同產地的牦牛肉[28]，但關于牦牛肉中穩定同位素指紋與牧草、飲水、地形的具體變化規律還不很明確?！緮M解決的關鍵問題】本研究重點分析牦牛肉中穩定碳、氮、氫同位素指紋特征和它們受牧草、飲水的影響，以及隨地域海拔的變化情況，揭示牦牛肉中穩定同位素指紋特征及變化規律。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從青海省海北、海南、玉樹3個點采集了32頭牦牛的肌肉樣品，并采集了13個牧草樣品和12個飲水樣品，采樣具體信息見表1。

表1 樣品及來源地信息

1.2 試驗方法

1.2.1 采樣方法

肌肉：屠宰后在每頭牛的后臀部取500 g肉，裝入自封袋中，-20℃冰箱中冷凍保藏。

飲水：在放牧牦牛附近的河邊采取河水樣品，裝入塑料瓶中，倒置、低溫保存。

1.2.2 樣品前處理方法

肌肉：解凍、取50 g切成小塊，冷凍干燥后，用球磨機磨碎；磨碎后的牛肉粉用索氏提取器進行脫脂，得到脫脂牛肉和粗脂肪樣品[18]。

牧草：70℃烘干、粉碎、過80目篩[17, 29]。

飲水：用孔徑為0.45 μm的濾膜過濾后備用。

1.2.3 穩定碳、氮同位素比率檢測方法

在傳統數學教學中，教師只是專注于教材知識的講解，常常忽略了學生的主體性地位，與學生之間互動較少，導致課堂氣氛枯燥、無聊，無法提起學生的學習興趣。對此，教師應提高課堂趣味性，讓學生對數學產生興趣。練習本身就不可避免地帶有枯燥、單調的特質，而數學習題由于充斥著大量的符號和數字，就顯得尤為枯燥。小學生的認知能力和注意力有限，他們對過于單調重復的習題容易喪失興趣和注意力。因此，教師在設計習題內容時，還需考慮習題的趣味性，增設趣味性習題以調動學生的積極性。例如，教師可以根據教學內容和學生的年齡特點，安排故事類和探究類習題來激發學生的學習興趣。

稱取2—3 mg樣品，放入錫箔杯中，通過自動進樣器進入元素分析儀（vario PYRO cube，Elementar，Germany），燃燒與還原轉化為純凈的CO2和N2，CO2再經過稀釋器稀釋，最后進入穩定同位素質譜儀（IsoPrime100，IsoPrime，UK）進行檢測。具體的工作參數如下：

元素分析儀條件：燃燒爐溫度為1020℃，還原爐溫度為600℃，載氣He 流量為230 mL·min-1。

質譜儀條件：分析過程中，每12個樣品穿插一個實驗室標樣IAEA 600（δ13CPDB=(-27.771±0.043)‰，δ15Nair=(1.0±0.2)‰）對測定結果進行校正。

穩定同位素比率計算如下：

δ（‰）=（R樣品/R標準-1）×1000

式中，R為重同位素與輕同位素豐度比，即13C/12C 和15N/14N，δ13C的相對標準為V-PDB，δ15N的相對標準是空氣中氮氣。測定時，δ13C和δ15N的連續測定精度＜0.20‰。

1.2.4 穩定氫同位素比率檢測方法

采用高溫裂解-同位素比率質譜法（HT-IRMS）進行測定。對于固體樣品，稱取1 mg樣品裝入銀杯中（高6 mm，直徑4 mm），折成小球，每個樣品有3個重復樣，并按順序放入96孔酶聯免疫板中，松散地蓋上蓋子，在實驗室的室溫環境下平衡72 h；通過固體自動進樣器進入元素分析儀（vario PYRO cube，Elementar，Germany），1 450℃高溫裂解生成CO和H2，經過稀釋器稀釋，最后進入質譜儀（IsoPrime 100，Isoprime，UK）進行檢測。對于水樣品，利用液體進樣器的針頭吸取0.4 μL 樣品直接進入元素分析儀，1 450°C高溫裂解成H2，進入質譜儀進行檢測。具體的工作參數如下：

元素分析儀條件：He載氣流速為120 mL·min-1。

質譜儀條件：分析過程中，每12個樣品穿插一個國際標樣IAEACH-7（δ2HV-SMOW=(-100.3±2)‰）對測定結果進行校正。

穩定氫同位素比率計算如下：

&=(R樣品/R標準-1)×1000

式中，R為重同位素與輕同位素豐度比，即2H/1H，δ2H的相對標準為V-SMOW。測定時，δ2H的連續測定精度＜1.00‰。

1.3 數據處理

用SPSS 18.0軟件對數據進行方差分析、Duncan多重比較分析等。

2 結果

2.1 牦牛肉中穩定同位素組成特征

脫脂肌肉、粗脂肪中的δ13C平均值分別為（-23.99± 0.25）‰和（-28.77±0.50）‰，說明牦牛采食的牧草主要是C3植物。脫脂肌肉中的δ13C值顯著高于粗脂肪，平均高5‰。脫脂肌肉中的δ15N和δ2H平均值分別為（4.04±0.91）‰和（-107.99±11.08）‰（表2）。可見，牦牛肉中穩定同位素指紋具有獨特的特征。

表2 牦牛肉中δ13C、δ15N和δ2H值

2.2 牦牛肉中穩定同位素組成與地域海拔的關系

玉樹牦牛肉中的δ13C值顯著高于海北和海南，但δ15N值在3個地域之間無顯著差異。海北、海南、玉樹3個地域的牦牛肉中δ2H值均有極顯著差異，由高到低的順序依次為海南＞海北＞玉樹，玉樹牦牛肉中的δ2H值比海北、海南約低20‰左右。玉樹的平均海拔（4 333 m）比海北（3 155 m）、海南（3 250 m）高1 000 m，這說明牦牛組織中的δ13C值有隨海拔的增加而增大的趨勢，而δ2H值有隨海拔的增加而減小的趨勢（表3）。

2.3 牦牛肉穩定同位素組成與牧草和水的關系

海北、海南、玉樹3個地區牧草中δ13C平均值分別為（-26.99±0.36）‰、（-27.16±0.17）‰、（-26.77±0.48）‰（表4），說明均為C3牧草。3個地區牧草中δ13C值、δ15N值均無顯著差異（表4），其平均值分別為（-26.96±0.37）‰和（-0.50±1.68）‰。3個地區牦牛脫脂肌肉中的δ13C、δ15N平均值分別為-23.99‰和4.04‰（表2），即牦牛脫脂肌肉相對牧草δ13C平均富集了2.87‰，相對牧草δ15N平均富集了4.54‰。3個地區牧草和水中的δ2H值均有極顯著差異，牧草中δ2H值由高到低的順序依次為海南＞海北＞玉樹，水中δ2H值由高到低的順序依次為海北＞海南＞玉樹（表4）。牦牛肌肉中δ2H值由高到低的順序依次為海南＞海北＞玉樹（表3），與牧草中δ2H值的地域變化順序一致。說明牦牛肉中的δ2H值與牧草、飲水密切相關，均有隨海拔升高而降低的趨勢，且牧草對牦牛組織中氫同位素組成的影響可能大于水的影響，但這還需要進一步研究證實。

表3 不同地域來源牦牛組織中δ13C、δ15N和δ2H值

同一橫列不同字母表示有顯著差異（＜0.05）

the different letters in the same rows mean significant difference (＜0.05)

表4 不同地域來源牧草和飲水中δ13C、δ15N和δ2H值

同一豎列不同字母表示有顯著差異（＜0.05）

The different letters in the same columns mean significant difference (＜0.05)

3 討論

牦牛生長的青藏高原地區牧草大多為C3植物，致使食用天然牧草的牦牛肉中δ13C值均在-23‰以下，顯著低于我國普通牛肉中的δ13C值[20]。Wang等[30]從海拔為2 700—5 400 m青藏高原采集的牧草樣品分析結果也表明，61個植物樣品中僅有4個是C4植物，其余均為C3植物，且C3植物δ13C值的變幅為-22.2‰—-28.3‰，平均值為（-25.7±1.4）‰（n=56）。本研究從青海海北、海南、玉樹采集的13個牧草飼料均為C3植物，其δ13C平均值為（-26.96±0.37）‰。玉樹牦牛組織中δ13C值顯著高于海北和海南，說明牦牛組織中的δ13C值有隨海拔的增加而增加的趨勢。前人在對植物δ13C值的海拔效應研究中也發現此變化規律[31-33]。與前人研究結果比較，食用天然牧草的牦牛肉中δ13C值與國外純牧草喂養的牛肉中δ13C值比較一致，均低于-23.00‰，而顯著低于中國主產區牛肉的δ13C值；牦牛肉中δ15N值顯著低于國外牧草喂養的牛肉，而與中國主產區牛肉的δ15N值接近[17,20]；牦牛肉中δ2H值顯著低于中國主產區牛肉的δ2H，尤其高海拔地區牦牛肉中δ2H值很低，基本在-120.00‰以下[20]。

牦牛組織中δ15N值平均在4‰左右，比前人研究報道的牦牛骨骼化石中δ15N值（3.2‰，n=5）略高[34]。牦牛組織中δ15N值與我國農區普通牛肉中δ15N比較接近，但低于牧區普通牛肉和國外牧草喂養的牛肉[17, 20]。海北、海南、玉樹3個地域的牦牛組織中δ15N值無顯著差異。動植物組織中δ15N值受地域土壤類型、施肥、牧草等影響因素，同一地域的變幅比較大，常導致不同地域之間的差異不顯著。

本研究牦牛組織中δ2H值有隨海拔的升高而顯著降低的趨勢，此變化與牧草、飲水的變化趨勢一致。前人在動物組織δ2H值與地域海拔關系方面也有相關研究，但研究結論存在一定異議。Hobson等[35]對厄瓜多爾安第斯山脈的蜂雀進行研究發現，在高度為400 m以上的區域，蜂雀羽毛中的δ2H值隨著高度的增加而降低（=0.53，＜0.001）；在高度為1 300— 3 120 m的范圍內，鳥羽毛中的δ2H值與高度也呈顯著負相關（=0.34，＜0.001）。他們認為，羽毛中的δ2H值是研究鳥遷徙高度或群居高度比較好的指標。但Kelly等[36]研究卻發現威爾遜鳴鳥羽毛中δ2H與高度之間的相關性不顯著。我國四大肉牛產區的普通牛肉中δ2H與海拔的關系也不明顯[37]。動物組織中δ2H值海拔效應不顯著的研究結果可能是由于采樣地區之間的海拔變化不明顯導致。本研究確證了動物肌肉中δ2H值的海拔效應，即隨著海拔的升高而降低。牦牛肉中δ2H值主要與牧草和飲水密切相關，本研究中牦牛肉δ2H值與牧草δ2H值的地域變化順序一致，推測牧草對牦牛肉中氫同位素組成的影響可能大于水的影響，此推測與前人的研究結果有一致性。O’Brien等[38]研究發現飲水對人毛發中δ2H值的貢獻率約為36%；Sharp等[39]研究發現飲水對人毛發中δ2H值的貢獻率約為31%；Hobson等[40]研究發現飲水對鵪鶉羽毛中δ2H值的貢獻率約為26%—32%，對鵪鶉趾甲中δ2H 值得貢獻率約為27%，其余70%的貢獻率是受飲食的影響。牧草和飲水對牦牛組織中δ2H值的影響貢獻率還有待進一步研究。

4 結論

食用天然牧草的牦牛肌肉中δ13C一般低于-23.00‰，顯著低于中國主產區牛肉的δ13C值；牦牛肉中δ15N值與中國主產區牛肉的δ15N值接近，平均值為4.04‰；牦牛肉中δ2H值顯著低于中國主產區牛肉的δ2H，尤其高海拔地區牦牛肉中δ2H值很低，基本在-120.00‰以下。牦牛組織中δ13C、δ15N值主要受其食用的牧草影響，δ2H值與其飲水和牧草密切相關；牦牛組織中δ13C值有隨海拔的增加而增加的趨勢，而δ2H值有隨海拔的升高而降低的趨勢。牦牛肉中穩定同位素指紋具有獨特的特征。

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（責任編輯 楊鑫浩）

The Characters andInfluence Factors of Stable Isotope Fingerprints in Yak Muscle

GUO Boli, WEI Yimin, WEI Shuai, Sun Qianqian, ZHANG Lei, SHI Zhenqiang

(Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-products Quality and afety Control in Storage and Transport Process, Ministry of Agriculture, Beijing 100193)

【Objective】the characters of carbon, nitrogen and hydrogen isotopic composition in yak () muscle and the effect of geographical origin, pasture and drinking water were analyzed, which would provide the technical support for tracing and identifying the yak meat. 【Method】The yak muscle, pasture and water samples were collected from Haibei, Hainan and Yushu of Qinghai province, and longitude, latitude and altitude of sampling site were recorded by using GPS. The carbon, nitrogen and hydrogen stable isotopic ratio in samples were tested by using EA-IRMS. 【Result】The average value of δ13C in yak de-fatted muscle and fat was (-23.99±0.25)‰ and (-28.77±0.50)‰, respectively, and the average value of δ15N and δ2H in yak muscle was (4.04±0.91)‰ and (-107.99±11.08)‰, respectively. The δ13C and δ15N values in yak muscle were closely related to the pasture of the Tibetan Plateau, and the region had certain effect on δ13C values of yak muscle, indicating the δ13C values increased with the altitude increasing. The δ2H values of pasture and water samples among three regions of Haibei, Hainan and Yushu of Qinghai province showed significant differences. The order of δ2H values in pasture was Hainan＞Haibei＞Yushu, and the order of δ2H values in water was Haibei＞Hainan＞Yushu. The order of δ2H values in yak muscle was Hainan＞Haibei＞Yushu, and it was the same order as the pasture. The results indicated that the δ2H values in yak muscle were closely related to the drinking water and pasture, and they were decreased with altitude increasing, and the pasture probably had more effect on δ2H values in yak muscle than water. But it needs to be further researched and confirmed.【Conclusion】The stable isotopic fingerprints in yak muscle were closely related to the pasture, drinking water and terrain of high altitude, which had the unique fingerprints character.

yak muscle; stable isotope fingerprints; pasture; drinking water

2017-12-27；

2018-05-04

西藏自治區重點科研項目（ZD20170014）

郭波莉，Tel：010-62815846；E-mail：guoboli2007@126.com