鏈霉菌30702的鑒定及其生防特性

叢子文 焦敬華 周雙清 黃東益 吳文嬙 許云 夏薇 張榮萍 黃小龍

（海南大學熱帶農林學院，?？?570228）

鏈霉菌屬（Streptomyces）是放線菌中最大的一類成員，也是產抗生素最多的放線菌菌屬［1］。目前鏈霉菌屬有效發表種823個，亞種38個（http://www.bacterio.net/streptomyces.html）。鏈霉菌屬有效發表種的模式菌株在16S rRNA基因序列系統發育樹上分散歸簇于不同的進化分枝（Clade）［2］，每個clade中的菌株大多具有相似的表型和基因型特征以及生物活性，但又存在種間的區別。紫黑鏈霉菌進化分枝（Streptomyces violaceusniger 16S rRNA gene clade）是其中一個重要的分枝，由Sembiring 等［3］推薦建立，當前包含26個有效發表種［4］。該進化分枝的放線菌普遍產生豐富的活性物質包括抗菌劑［5-11］、抗腫瘤劑［12-13］、生防制劑［14-19］、生物催化劑［20］、磷脂酶抑制劑［21］和免疫抑制劑［22］，在醫藥和農用抗生素的開發上得到了廣泛的應用。

近年來可培養及未培養的研究發現，紫黑鏈霉菌進化分枝放線菌在植物根際、落葉堆、海泥等具有廣泛的分布［23］。Sembiring 等［3］從南洋楹（Paraserianthes falcataria）植物根際分離到大量紫黑鏈霉菌進化分枝放線菌新物種。Sahin等［24］發現紫黑鏈霉菌進化分枝放線菌在土耳其豆類植物根際具有多樣性的分布。Kang等［25］從三齒蒿（Artemisia tridentate）根際分離到的紫黑鏈霉菌進化分枝放線菌菌株對植物病原真菌和白色念珠菌具有廣譜的抗性。我們前期的研究證實，紫黑鏈霉菌進化分枝的放線菌菌株在海南藥用植物根際也有一定的分布［26］，并從藥用植物海南粗榧根際分離得到一株紫黑鏈霉菌進化分枝的鏈霉菌30702，該菌株對山藥炭疽病菌、芒果炭疽病菌、香蕉枯萎病菌等植物病原真菌都顯示出強烈的拮抗活性［27］。本研究對其種水平的分類地位和生防特性進行深入研究，以期為該菌株在植物生防菌劑的開發與應用上提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供試菌株30702，由本實驗室前期從熱帶藥用植物粗榧根際土壤中分離得到。供試山藥炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）由本實驗保存。

1.1.2 培養基 發酵培養基：可溶性淀粉25 g，黃豆粉20 g，MgSO4.7H2O 0.6 g，CaCO30.2 g，水1 000mL，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 鏈霉菌30702的DNA提取、PCR擴增及測序 參照周雙清等［28］方法進行菌株DNA 的提取。選取16S rRNA 基因和5個看家基因atpD、gyrB、recA、rpoB和trpB為實驗對象。它們在放線菌的基礎代謝中行使不同的功能。其中atpD 基因編碼F0F1-ATP 合成酶β亞基；gyrB基因編碼DNA解旋酶β亞基；recA 基因編碼重組酶A；rpoB 基因編碼RNA 聚合酶β亞基；trpB基因編碼色氨酸合成酶β亞基。各基因序列PCR 擴增的條件參照Guo等［29］的方法，目標片段（TaKaRa試劑盒）回收、純化后與pMD18-T載體連接，轉化感受態細胞后，篩選陽性克隆送廣州天一輝遠基因科技有限公司測序。

1.2.2 鏈霉菌30702系統進化樹構建及MLSA多位點序列分析 將獲得的16S rRNA 基因序列登錄EzTaxon 數據庫中作blast 序列比對，同時下載相關相似菌株序列，用Mega6.0 軟件構建系統進化樹。獲得的atpD、gyrB、recA、rpoB和trpB基因序列，參照Guo等［29］的方法，首尾相連拼接成多基因序列，并在GenBank數據庫下載相關菌株的5個看家基因序列拼接成多基因序列，采用Mega6.0 軟件構建系統進化樹，利用Kimura 2-parameter（K2P）模型計算多位點序列進化距離。

1.2.3 鏈霉菌30702形態及培養特征分析 培養特征描述所用培養基參照國際鏈霉菌規劃中的標準培養基［30］。將供試菌株30702分別接種到ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6和ISP7瓊脂培養基，28℃恒溫培養7-21 d，觀察并記錄放線菌菌落形態及培養特征。

1.2.4 鏈霉菌30702生理生化特征 溫度試驗、pH試驗、耐鹽度測定、脲酶試驗、明膠液化、硝酸鹽還原、碳源利用實驗和氮源利用實驗參照文獻［31］的方法進行。

1.2.5 鏈霉菌30702細胞壁化學分析 供試菌株30702的細胞壁氨基酸和糖組分分析參照Lechevalier等［32］的方法。

1.2.6 鏈霉菌30702的產酶特性 供試菌株30702產蛋白酶、纖維素酶、幾丁質酶、β-葡聚糖酶等檢測方法參照文獻［33］。

1.2.7 鏈霉菌30702促生長特性 供試菌株30702產鐵載體、解磷活性、產1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶以及體外促進植物生長等方法參照文獻［34］。其中體外促進植物生長試驗具體如下：將菌株30702接種在MS 培養基上，28℃培養3 d，3 d后將擬南芥種子種植在MS培養基的另一端，距離菌株30702 5 cm，22℃，16 h光照，8 h黑暗交替培養7 d。以未接菌的MS 培養基為對照，電鏡觀察擬南芥幼苗的根及根毛。掃描電鏡照片由海南大學測試中心完成。

1.2.8 菌株30702發酵粗提物制備 將菌株30702接種發酵培養基中（200 mL培養基/500 mL三角瓶），180 r/min，28℃恒溫培養7 d。將發酵液離心（4℃，4 000 r/min，10 min），除去上清，得到菌體。向菌體中加入50 mL丙酮。搖床上振蕩浸提2 h，離心收集上清液，旋蒸蒸發儀蒸干得發酵粗提物。

1.2.9 菌株30702發酵粗提物 抑制山藥炭疽菌孢子萌發、菌絲生長 取10 μL山藥炭疽菌的孢子懸浮液（孢子濃度為107個/mL）與 20 μL的葡萄糖溶液（1g/L），以及一定量的發酵粗提物混合均勻，發酵粗提物終濃度分別設置為 0 μg/ mL，15 μg/ mL，25 μg/mL，50 μg/ mL，75 μg/ mL 和 100 μg/ mL，滴加在無菌的血球計數板上，放置在無菌的培養皿里。28℃保濕培養24 h，觀察孢子萌發和菌絲形態。

2 結果

2.1 菌株30702的菌種鑒定

2.1.1 菌株30702 的16S rRNA基因序列分析 PCR擴增菌株30702的16S rRNA基因序列，獲得其序列全長為1 481 bp。在EzTaxon 數據庫中進行比對檢索，發現菌株30702與紫黑鏈霉菌進化分枝的有效發表種的序列最相似，其中相似性前三位的菌株 為 Streptomyces solisilvae HNM0141T，Streptomyces malaysiensis NBRC 16446T和Streptomyces samsunensis M1463T，相似性分別為100%、99.4%和98.8%。選取相似性較高的標準菌株序列，利用MEGA6.0 軟件采用N-J 法（重復度1 000）構建系統進化樹（圖1）。結果表明菌株30702與S. solisilvae HNM0141T，S. malaysiensis NBRC 16446T和S. samsunensis M1463T聚在同一個大的分支上，說明菌株30702與這3株菌的親緣關系較近，其中菌株30702與S. solisilvae HNM0141T又聚成一個小分支，表明S. solisilvae HNM0141T是菌株30702親緣關系最近的標準菌株，因此選取這3株作為下述實驗的參照菌株。

圖1 菌株30702的16S rRNA基因序列系統進化樹

2.1.2 菌株30702 的MLSA分析 擴增獲得菌株30702的5個看家基因atpD、gyrB、recA、rpoB和trpB基因序列，并首尾相連拼接成多基因序列與菌株S. solisilvae HNM0141，S. malaysiensis NBRC 16446和S. samsunensis M1463的多基因拼接序列等構建系統進化樹（圖2）。菌株30702與鏈霉菌S.solisilvae HNM0141，S. malaysiensis NBRC 16446和S. samsunensis M1463同樣聚在一單獨的分支上，其中菌株30702與鏈霉菌S. solisilvae HNM0141又聚在同一個小分支上。遺傳進化距離計算（表1）表明，菌株30702與鏈霉菌S. solisilvae HNM0141的多基因序列進化距離為0.004，與其他兩株菌的多基因序列進化距離均大于0.007（分別為0.118和0.112）。

圖2 菌株30702基于5個看家基因串聯的進化樹

表1 菌株30702 與參照菌株的多基因序列進化距離

2.1.3 形態及培養特征分析 菌株30702在ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6和ISP7六種培養基上生長良好，氣生菌絲為綜色、粉白色或灰色，基內菌絲為深灰色、棕黃色、亮黃色和黃綠色；在所有培養基上不產生色素（表2）。菌株30702與S. solisilvae HNM0141在形態和培養特征上最相似，而與S.malaysiensis NBRC 16446和S. samsunensis M1463則存在一定差異。

2.1.4 生理生化特征 菌株30702與3株參照菌株均能利用供試的9種常見碳源（表3）；菌株30702能夠利用丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、纈氨酸、甘氨酸和賴氨酸最為惟一氮源，不能利用酪氨酸、酪蛋白和組氨酸作為氮源（表4）。與參照菌株相比，菌株30702與S. solisilvae HNM0141在氮源利用能力上更相近，與其他兩株菌存在差異，如菌株30702能夠利用亮氨酸和苯丙氨酸，而S.malaysiensis NBRC 16446和S. samsunensis M1463不能，菌株30702能夠利用精氨酸和纈氨酸，而S.samsunensis M1463則不能。

菌株30702與所有參照菌株在明膠液化、脲酶實驗、硝酸鹽還原實驗、淀粉水解實驗均為陽性（表5），生長溫度范圍均為20-40℃，生長的酸度范圍均為pH5-10。菌株30702在鹽度為7%時仍能生長，S. samsunensis M1463和S. solisilvae HNM0141在鹽度為5%時均能生長，S. malaysiensis NBRC 16446在鹽度為4%時能生長，在5%時不能生長。這說明菌株30702的耐鹽性更好。

2.1.5 細胞壁化學分析 菌株30702細胞壁氨基酸成分主要有甘氨酸和L-DAP；細胞壁糖類成分主要為半乳糖。表明菌株30702與鏈霉菌的細胞壁化學特征相符。

2.2 鏈霉菌30702的生物防治特性

菌株30702能夠產生蛋白酶、纖維素酶、幾丁質酶、β-葡聚糖酶和ACC脫氨酶以及產生鐵載體，并且具有解磷的能力。同時，菌株30702能夠促進擬南芥的生長，在MS培養基上表現為生長茂盛，葉片厚而綠，根毛較長且數目較多（圖3-B，3-b）。而對照組葉片薄而發黃，根毛數目少，根短，植物生長弱（圖3-A，3-a）。

2.3 菌株30702發酵粗提物抑制炭疽菌孢子萌發和菌絲生長

菌株30702發酵粗提物對山藥炭疽菌孢子的萌發和菌絲的生長具有較好的抑制作用。在發酵粗提物濃度為15 μg/mL時，抑制率為（90.33±0.5）%；發酵粗提物濃度為25 μg/m時，抑制率為（90.53±0.8）%；發酵粗提物濃度為50 μg/m時，抑制率為（93.35±0.8）%；發酵粗提物濃度為75 μg/m時，抑制率為（96.82±0.9）%；發酵粗提物濃度為100 μg/m時，抑制率為（99.33±0.6）%。隨著濃度的增加，抑制效果越來越顯著。在濃度達到100 μg/mL時，抑制率幾乎為100%（圖4）。

表2 菌株30702與參照菌株培養特征的比較

表3 菌株30702與參照菌株碳源利用試驗

3 討論

鏈霉菌是一類具有重要應用價值的生防放線菌資源，其分類地位的確認是深入研究其生防功能的前提。16S rRNA基因序列分析是快速確認放線菌分類地位最常用的方法之一［35］。但基因組內的多拷貝性致使16S rRNA 基因不能很好的區分屬內密切相關的物種，尤其是鏈霉菌屬同一clade中的種［36］。因此，一些分類學家推薦聯合使用多個看家基因串聯的多位點序列比較（MLSA）來鑒定鏈霉菌種的分類地位［36-37］。研究表明鏈霉菌MLSA的進化距離與DNA-DNA雜交（DDH）之間表現出很強的數據相關性，70%的DDH值匹配性于0.007的MLSA距離［38］。本實驗的前期研究中，采用PCR產物直接測序的方法獲得了菌株30702的16S rRNA基因部分序列，通過序列比對分析將菌株30702初步鑒定為鏈霉菌屬紫黑鏈霉菌進化分枝中的放線菌［27］，但其種水平的分類地位尚未確定。

表4 菌株30702與參照菌株氮源利用試驗

表5 菌株30702與參照菌株其它生化試驗

圖3 菌株30702體外促進擬南芥的生長

圖4 菌株30702發酵粗提物對炭疽菌孢子萌發的影響

本研究通過轉化克隆測序的方法獲得了菌株30702的16S rRNA基因的全長序列（1481 bp），通過序列比對和16S rRNA基因系統進化樹分析，確認 了 Streptomyces solisilvae HNM0141T，Streptomyces malaysiensis NBRC 16446T和Streptomyces samsunensis M1463T為該菌株親緣關系相對較近的參照菌株。其中Streptomyces solisilvae HNM0141T與菌株30702的親緣關系最近，相似性達到100%，因此基本推斷菌株30702為Streptomyces solisilvae。為了驗證這種推斷，本研究將菌株30702與參照菌株進行了MLSA多位點序列分析。結果表明菌株30702與S.solisilvae HNM0141的MLSA進化距離小于0.007（種的界限），與其他參照菌株的MLSA進化距離均大于0.007。根據Rong和Huang［38］的觀點，菌株30702與S. solisilvae HNM0141理應歸屬于同一個種，而區別于其他兩株參照菌。此外，形態及生理生化特征的比較結果也支持了這種結論。因此，菌株30702最終被鑒定為紫黑鏈霉菌進化分枝中的Streptomyces solisilvae。

放線菌的生防特性國內外已有一定的報道，主要包括產抗生素、鐵載體、水解酶（幾丁質酶、β-葡聚糖苷酶、蛋白酶等）和誘導寄主抗病性等［39］。本研究的菌株30702的發酵粗提物能顯著抑制山藥炭疽菌孢子的萌發和孢子絲的生長，表明該菌株產生了抗真菌作用的抗生素。同時，檢測到菌株30702產生蛋白酶、幾丁質酶、纖維素酶和β-葡聚糖苷酶等水解酶，這些水解酶據報道都能瓦解絲狀病原真菌的細胞壁，從而抑制病菌的生長發育［40］。其次，菌株30702還具有產生鐵載體的能力，可以通過捕獲鐵離子達到抑制植物病原菌生長的目的［40］。此外，菌株30702還具有促植物生長的特性，接種的擬南芥表現為根增長，根毛數目增多，葉片厚而發綠，植株生長茂盛。這可能與菌株30702具有解磷作用和產ACC脫氨酶有關，有報道表明生防細菌通過產生激素、ACC脫氨酶以及解磷作用等改善植物根的發育，達到促進植物生長的目的［41］。因此，上述研究結果綜合表明菌株30702具有優良的生防特性，預示其在植物病害的生物防治上具有較好的潛在應用前景。但其抗生素的化學結構、作用機制、發酵工藝、制劑研發、應用方式等尚需進一步的深入研究。

4 結論

本實驗室從海南粗榧根際分離到一株鏈霉菌30702，通過16S rRNA基因序列和多位點序列分析、并結合形態和生理生化特征比較分析，將鏈霉菌30702鑒定為紫黑鏈霉菌進化分枝中的Streptomyces solisilvae。該菌株能夠產生蛋白酶、纖維素酶、幾丁質酶、β-葡聚糖酶、ACC脫氨酶、鐵載體，具有解磷活性和促進植物生長的特性，發酵代謝產物能夠抑制山藥炭疽菌孢子萌發和菌絲生長。

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