磷尾礦土壤中解磷細菌的篩選及解磷能力的測定

陳佳興 秦琴 邱樹毅 王雪酈，3

（1. 貴州省貴州大學發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴陽 550025；2. 貴州大學釀酒與食品工程學院，貴陽 550025；3.貴州大學生命科學學院，貴陽 550025）

中國是一個磷礦資源豐富的大國，據2013-2014年美國地質調查局研究數據顯示，中國現有磷礦儲量約37億t，占全球儲量的5.5%，位居全球第二［1-2］。中國磷礦資源雖豐富但分布極為不均，主要集中在云南、四川、貴州、湖北等地區［3］。除分布不均外，中國磷礦還具有富礦少、貧礦多等不足，全國磷礦平均品位在17%左右［4-6］。貴州磷礦多以無機磷鹽形式存在，全省磷礦平均品位為22.14%，磷礦質量居全國之首，以此資源為依托已建立了全國最重要的磷礦石和磷化工基地［7-9］。然而，磷礦在實際生產中經化學浮選工藝后將產生大量的磷尾礦渣，其組分特征為w（P2O5）≤10%［10］，因含磷量低，屬工業固體廢棄物。目前采用丟棄或庫存的方式處理，給環境造成一定影響，因此磷尾礦的綜合再利用備受企業和學者的關注。現階段，我國磷尾礦的綜合利用率僅有7%，利用途徑包括直接施用于土壤中、利用化學浮選法或磁選法提取有用礦物、利用酸解法制備化學復合肥及制備建筑材料［11-14］。其中，通過酸解法制備的磷肥復合肥［15］，在使用中不僅降低了植物的吸收利用率［16］，還會導致土壤出現板結等現象。因此，探索一種更環保、更高效的磷尾礦綜合利用途徑具有非常重要的意義。

近年來，隨著應用生物技術的發展，大量解磷微生物涌現出來。解磷微生物是一類能將難溶性磷酸鹽轉化為可溶性磷酸鹽的微生物。目前已知的具有解磷能力的微生物包括細菌、真菌和放線菌等，其中解磷細菌的數量和種類較多。國內外報道的解無機磷細菌主要有產堿菌屬（Alcaligenes）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、歐文氏菌屬（Erwinia）、沙門氏菌屬（Salmonella）、沙雷氏菌屬（Serratia）、多硫桿菌屬（Thiobacillus）等［17-20］。鐘傳青和 Gadd等［21-22］就解磷細菌的解磷機制進行探索，研究發現解磷細菌能分泌磷酸酶和某些低分子量的有機酸，后者可向環境中提供質子和有機酸陰離子，從而促使難溶性的磷酸鹽溶解［22］。故可利用解磷微生物制備解磷菌肥，此肥料不僅可提高土壤中磷的利用率，還可減少化學磷肥的使用量［23］。現階段，解磷微生物在實際生產中已有應用，但其多樣性不高，因此篩選出具有高效解磷性能的微生物，仍然是生產解磷菌肥的一項重要工作［24-26］。

本研究從貴州甕福磷尾礦堆積場采集的土壤樣品中篩選出高效解磷微生物，并通過菌株形態特征、生理生化和16S rDNA基因序列分析以及系統發育樹對其菌株進行鑒定，并探索其對難溶性磷酸鹽的解磷能力，為今后開發和利用解磷菌肥提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 101-1AB電熱恒溫干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；BMJ-250C培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備；JJ-CJ-IFD型超凈工作臺：蘇州市金凈凈化設備科技有限公司；正置熒光顯微鏡：奧林巴斯Olympus；FA-2004N電子分析天平：上海菁海儀器有限公司；Heraeus Multifuge X3R大容量冷凍離心機：美國Thermo Fisher公司；721可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；PHS-3C型精密酸度計：上海大普儀器有限公司；PCR 擴增儀：德國 Jena；核酸電泳儀：德國 Jena。

1.1.2 試劑 細菌基因組DNA 提取試劑盒購自美國BIOMIGA 公司。磷酸三鈣、葡萄糖、氯化鈉和瓊脂等試劑均為國產分析純。

1.1.3 樣品來源 磷礦土壤樣品從貴州甕福磷尾礦堆積場采集。

1.1.4 培養基 無機磷選擇性固體培養基：葡萄糖10.0 g，Ca3（PO4）25.0 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0-7.5，121℃滅菌20 min。其中以Ca3（PO4）2作為磷源，需與其他藥品分開滅菌后混合。牛肉膏蛋白胨固體培養基：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 3.0 g，氯化鈉 5.0 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0-7.4，115℃滅菌30 min。上述兩種培養基的配方中去掉瓊脂即可制成液體培養基。

1.2 方法

1.2.1 解磷細菌的分離篩選及純化 稱取5 g土壤樣品，加入盛有45 mL 無菌生理鹽水的錐形瓶中，制成稀釋度為10-1的土壤懸液，置于30℃的搖床中振蕩30 min。將土壤懸液按10倍梯度制成10-2-10-6，并各取上述梯度的土壤懸液0.2 mL均勻涂布在無機磷選擇性固體培養基上，每個稀釋度重復3 次。將其倒置于30℃恒溫培養箱中培養4-5 d后，用接種環挑取具有溶磷圈的單菌落在牛肉膏蛋白胨固體培養基上進行分離及純化。將純化后的菌種分別點接于無機磷選擇性固體培養基上，在30℃條件下培養4-5 d后觀察溶磷圈產生情況，通過十字交叉法測量溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d）。根據是否產生溶磷圈及D/d值的大小來初步確定菌株的溶磷能力，篩選出具有明顯溶磷圈的菌株轉接到牛肉膏蛋白胨斜面培養基上，置于4℃下保存。

1.2.2 形態學鑒定 將篩選得到的解磷細菌分別點種于牛肉膏蛋白胨固體培養基上，在30℃條件下培養2 d后觀察單菌落形態特征。

1.2.3 生理生化測定 參考第八版《伯杰氏細菌鑒定手冊》［27］測定糖醇發酵、淀粉降解、明膠液化、甲基紅試驗、檸檬酸鹽利用試驗等生理生化試驗，進行觀察和記錄。

1.2.4 分子生物學鑒定 將解磷細菌接入50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養基，置于30℃，180 r/min的搖床中振蕩2 d，然后使用細菌基因組DNA提取試劑盒（美國BIOMIGA公司）提取解磷細菌DNA。采用細菌16S rDNA通用上游引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和下游引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對解磷細菌進行PCR擴增。細菌PCR擴增體系為25 μL：細菌DNA模板 2 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，ddH2O 8.5 μL。細菌 PCR 反應程序 ：94℃預變性5 min后，94℃變性1 min，55℃退火1min，72℃延伸2 min，35個循環，然后72℃延伸10 min，4℃保存。擴增后的PCR產物用1%瓊脂糖凝膠，1×TAE電泳緩沖液，上樣5 μL，以5 V/cm電壓電泳檢驗，在凝膠成像儀系統進行觀察，拍照。再將PCR產物送至英淮捷基貿易有限公司測序，為保證序列的準確度，測序采用雙向測序。所得測序結果輸入美國國家生物技術信息中心NCBI（National Center of Biotechnology Information）數據庫進行比對，選取同源性較高的菌株序列作為參照，用MEGA 5.05軟件構建菌株系統發育樹，進行菌種鑒定。

1.2.5 磷含量標準曲線的繪制 參照NY/T 2421-2013《植株全磷含量測定 鉬銻抗比色法》［28］中磷含量標準曲線的繪制方法，以測得的吸光度為縱坐標，磷濃度為橫坐標繪制磷標準曲線。

1.2.6 解磷細菌溶磷能力及培養液pH值的測定［29］將篩選得到的菌株接種于50 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養基中，經30℃，180 r/min過夜培養后得到種子液，菌量約為1×108CFU/mL。再按1%的接種量接種到無機磷選擇性液體培養基中后，置于上述同等條件下培養7 d。以不接菌作為對照，每株菌設置3組平行。搖床培養1-7 d過程中每天定時取樣，一部分樣品用pH計直接測定培養液的pH值。另一部分樣品在10 000 r/min條件下離心5 min，上清液經0.45 μm濾膜過濾后用鉬銻抗比色法測定OD700值，根據磷含量標準曲線計算出上清液中磷的含量。

1.2.7 數據處理 試驗數據采用SPSS 22. 0和Excel 2003進行相關統計和分析，用Origin 8.5軟件作圖，表中數據均為3次重復的平均值。

2 結果

2.1 解磷細菌的分離篩選結果

在無機磷選擇性固體培養基上分離出4株菌落形態不同的菌株，分別編號為PSB1、PSB2、PSB3和PSB4。通過觀察這4株菌的溶磷圈大小（圖1）發現，PSB1、PSB3和PSB4具有明顯溶磷圈（表1）。

表1 溶磷圈法測量菌株的解磷能力

2.2 解磷細菌的鑒定結果

2.2.1 形態學鑒定 3株解磷細菌在30℃恒溫下培養2 d后菌落直徑可達3-5 mm，單菌落形態及描述見表2和圖2。

2.2.2 生理生化測定 對篩選所得菌株PSB1、PSB3和PSB4進行部分生理生化指標測定，結果見表3。3株菌在培養條件下均能利用檸檬酸鹽（鈉），并產生H2O2酶，不能產生H2S和賴氨酸脫羧酶。菌株PSB1僅能利用D-海藻糖、甘露醇和D-麥芽糖作為碳源進行生長代謝，而菌株PSB3能利用葡萄糖、蔗糖和甘露醇等多種糖醇，菌株PSB4不能利用任何一種碳源。

2.2.3 分子生物學鑒定 篩選所得3株解磷細菌的PCR產物擴增電泳圖如圖3所示，將PCR產物送至英淮捷基貿易有限公司測序，測序結果表明，PSB1、PSB3和PSB4目的片段大小分別為1 409 bp、1 400bp和 1 410 bp。

圖1 解磷細菌的溶磷圈圖

表2 三株解磷細菌菌落的形態描述

圖2 解磷細菌單菌落圖

將測序得到的3株解磷細菌16S rDNA基因序列輸入NCBI BLAST數據庫中與較為相似且已發表的菌株16S rDNA基因序列進行比對，再通過MEGA 5.0軟件，將3株解磷細菌與其同屬親緣關系較近的模式菌株進行同源性分析并構建系統發育樹，結果如圖4所示。PSB1與普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）菌株聚在同一分支，其序列同源性為99%；PSB3與嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）菌株聚在同一分支，其序列同源性為99%；PSB4與泡囊短波單胞菌（Brevundimonas vesicularis）菌株聚在同一分支，其序列同源性為99%。

表3 三株解磷細菌的生理生化特征

圖3 三株解磷細菌的PCR產物擴增圖

結合菌落形態特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析結果，最后鑒定菌株PSB1、PSB3和PSB4分別為普城沙雷氏菌、嗜麥芽窄食單胞菌和泡囊短波單胞菌。

圖4 三株解磷細菌株系統發育樹

2.3 磷含量標準曲線

由圖5可知，磷含量標準曲線回歸方程為y =0.500 4x-0.007 3，相關系數R2為 0.999 3。結果表明，兩者線性相關良好。

圖5 磷含量標準曲線

2.4 解磷細菌解磷能力及培養液pH值的測定

本實驗設計利用磷酸三鈣為唯一磷源，對其進行液態培養，采用鉬銻抗比色法測定了不同解磷細菌的解磷能力，結果見圖6和圖7。

如圖6所示，3株解磷細菌在7 d液態培養過程中培養液的pH值發生了明顯變化。在起初的24 h內，菌株PSB1、PSB3和PSB4培養液的pH值均顯著下降，由最初pH值7.00分別下降至4.47、4.51和4.99。這可能由于解磷細菌在生長代謝過程中產生了各種有機酸，如蘋果酸、檸檬酸等，導致培養液的pH值降低。直至培養到96 h時，菌株PSB3和PSB4培養液中的pH值降至最低，分別為4.30和4.35。菌株PSB1培養液在144 h時pH值降至最低，pH值為4.24。在三者pH值分別降至最低后，培養液pH值隨培養時間的延長變化趨勢并不明顯。

圖6 解磷細菌液態培養中pH值的變化

圖7 解磷細菌液態培養中溶磷量的變化

如圖7所示，3株解磷細菌在7 d液態培養過程中培養液內可溶性磷含量總體呈先增加，后逐漸平緩減少的變化趨勢。3株解磷細菌培養液中可溶性磷含量在0-48 h內變化顯著，分別迅速升高至 127.82 μg/mL、147.73 μg/mL 和 130.03 μg/mL。菌株PSB3培養液中可溶性磷含量在72 h時達到最高，為153.84 μg/mL，此后可溶性磷含量趨于穩定，但從96 h之后，該值出現緩慢降低的趨勢。同樣，菌株PSB1和PSB4培養液中可溶性磷含量在96 h時達到最高，分別為 148.87 μg/mL 和 146.76 μg/mL，此后隨著培養時間的延長，可溶性磷含量均有所下降，其中菌株PSB4培養液中可溶性磷含量下降較為明顯。由于解磷細菌在產生各種有機酸將磷酸三鈣溶解成可溶性磷的同時，菌體為維持自身生長代謝的需求將可溶性磷作為磷源將其利用，從而導致培養液中可溶性磷含量的降低。

3 討論

目前，許多研究者已分離出多種具有解磷能力的細菌。李白等［30］從土壤中分離得到3株解磷細菌，其中解磷能力最高可達到96.31 μg/mL。萬兵兵等［31］從鄭州市砂質潮土中分離出一株短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），最高解磷能力可達到128.90 μg/mL。余旋［32］對從四川核桃主產區根際篩選出的解磷細菌進行優化培養，最優解磷能力在200 μg/mL左右。與國內已報到的文獻相比，該實驗篩選所得的3株細菌PSB1、PSB3和PSB4的解磷能力均在150 μg/mL左右，都是具有較高解磷能力的菌種。

菌種PSB3被鑒定為嗜麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），目前對嗜麥芽寡養單胞菌的研究多以其耐藥性和對動植物感染與致病等方面為主［33-35］，在解無機磷方面鮮見報道。但通過該實驗可知，嗜麥芽寡養單胞菌的解磷效果理想，故今后可對其在提高磷尾礦中磷的利用率以及研發解磷菌肥等方面進行深入研究。

為了研究實驗篩選所得3株解磷細菌的解磷能力，對其進行液態培養。通過實驗結果可知，在液態培養初期，培養液中可溶性磷含量均隨著培養液pH值的降低而逐漸增加。但當培養液的pH值降至最低時，3株解磷細菌的解磷能力并非均達到最大值。通過SPSS 22.0軟件對3株解磷細菌培養液的pH值和其解磷能力做相關性分析，結果發現菌株PSB1和PSB4培養液中pH值與其解磷能力存在顯著的負相關性（P＜0.05），相關系數r分別為-0.897和-0.958。說明菌株PSB1和PSB4是通過分泌某些有機酸來溶解無機磷，導致培養液中pH值的降低，該結論與多數已報道的研究結論相一致［36-38］。而菌株PSB3培養液中pH值與其解磷能力不存在顯著相關性（P＞0.05），相關系數r為-0.675，表明菌株PSB3在液態培養過程中可能產生了除有機酸以外的非有機酸物質，促使無機磷溶解。Illmer等［39］研究發現黃灰青霉（Penicillium aurantiogriseum）和假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）PI1889只有在NH4+介質存在條件下才具有溶解無機磷酸鹽的能力，主要是因為呼吸作用或NH4+同化作用釋放出質子引起磷酸鹽的溶解，該項研究驗證了非生成有機酸溶解難溶性磷酸鹽的機理。故菌株PSB3同樣可能也存在非分泌有機酸的其他解磷機理，具體作用機制還有待進一步研究。

4 結論

本研究選取貴州甕福磷尾礦土壤為樣品，成功分離篩選出3株高效解磷細菌PSB1、PSB3和PSB4。通過對菌株的形態學特征、生理生化特征及分子生物學等技術和理論，初步鑒定菌株PSB1、PSB3和PSB4分別為普城沙雷氏菌、嗜麥芽窄食單胞菌和泡囊短波單胞菌。將上述菌種置于以磷酸三鈣為唯一磷源的無機磷液體培養基中，在30℃恒溫條件下培養7 d，測得最大解磷能力分別為148.87、153.84和146.76 μg/mL。菌株PSB1和PSB4培養液中pH值與其解磷能力存在顯著的負相關性，而菌株PSB3不存在，其解磷機理還需進一步研究。

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