耐冬山茶基因組DNA的提取及CDDP引物的篩選

雋逸豪 ，王紹霞 ，李春艷 ，馬 燕 ，臧德奎 *

（1.山東農業大學林學院，山東 泰安 271018；2.棗莊市山亭區國有山亭林場，山東 棗莊 277200；3.棗莊市山亭區林業局，山東 棗莊 277200）

山茶（Camellia japonica）是我國十大名花之一，栽培歷史悠久，品種繁多，具有極高的觀賞價值與經濟價值。其野生種群僅分布于江西、浙江、臺灣、四川、山東等省區，山東為其自然分布的北界，僅見于山東青島近海島嶼大管島、長門巖島，與大葉胡頹子（Elaeagnus macrophylla）等植物形成常綠闊葉矮林，這種特殊的生物地理現象對于研究植物區系分布和山茶屬的系統演化具有重要意義[1]。該地區的野生山茶又稱“耐冬”，是一種北方罕有的冬季觀花植物，也是山茶育種的珍貴種質資源。由于生境的破壞及對現有資源的不合理開發利用，現存的野生山茶數量越來越少，亟待保護。

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，影響物種的長期存在與進化，已經成為生物多樣性研究的熱點內容之一[2]。現代分子標記技術是植物遺傳育種研究的重要工具，基因組DNA的提取質量是影響實驗成敗的關鍵因素[3]。山茶葉片中含有多種次生代謝物質，如酚類、多糖等，這些物質的存在很大程度上影響了其基因組DNA的提取和分離，因此，選擇適當的提取方法以減輕這些物質對所得基因組DNA的影響是一項十分重要的工作。

CDDP標記是Collard和Mackill等于2009年開發的一種基于DNA保守序列的新型分子標記方法，是基于單引物擴增反應的標記技術。在植物的基因或基因家族中的保守氨基酸序列是典型的保守結構功能區域，其對應的DNA序列在不同物種間也是相當保守的。根據這些保守序列設計引物，實現對樣本的PCR擴增。該技術具有操作簡單、應用成本低、多態性豐富、重復性好等優點，其引物具有通用性，能產生豐富的遺傳信息[4]。在遺傳育種、親緣關系分析、品種分類鑒定工作中有重要作用。目前已應用于水稻（Oryza sativa）[5]、歐白英（Solanum dulcamara）[6]、 牡丹 （Paeonia suffruticosa）[7-8]、 菊花（Chrysanthemum×morifolium）[9]等植物種質資源的遺傳多樣性分析。目前國內外對山茶的研究多采用ISSR[10]、AFLP[11]、等位酶技術[12]等技術手段 ，未見CDDP技術應用于該領域的報道。

本實驗力圖找到適宜的耐冬山茶基因組DNA提取方法，篩選出高效的CDDP引物，為耐冬山茶的遺傳多樣性研究提供新的技術手段。

1 材料與方法

1.1 耐冬山茶基因組DNA的提取

1.1.1 實驗材料

實驗材料為采自大管島、長門巖島的共110份山茶幼嫩葉片。采集后立即加入硅膠干燥，密封保存于-20℃冰箱待用。

1.1.2 實驗儀器

低溫高速離心機；電泳儀；水浴鍋；紫外分光光度計；凝膠成像分析系統。

1.1.3 試劑

EDTA（pH 8.0）；Tris-HCl（pH 8.0）；2×CTAB 緩沖液（配方見表 1）；提取介質（配方見表 2）；PVP；β-巰基乙醇；氯仿-異戊醇（v：v=24：1）；70%乙醇；無水乙醇；1×TE；雙蒸水（ddH2O）；NaAc。

表 1 2×CTAB緩沖液配方Table1 The formulation of 2×CTAB buffer solution

表2 提取介質配方Table 2 The formulation of extraction medium

1.1.4 實驗方法

1.1.4.1 準備工作

①將離心管、移液器槍頭、提取介質等進行高壓蒸汽滅菌；②將離心管（2 mL、1.5 mL）標好編號；③打開水浴鍋升溫至65℃，將2×CTAB緩沖液置于水浴鍋中預熱備用；④用液氮預冷研缽和藥匙。

1.1.4.2 DNA 的提取

①稱取樣品0.2 g倒入滅菌干燥的研缽中，加入約30 mL液氮，少量PVP進行研磨。重復加入液氮2-3次充分研碎使樣品呈均勻粉末狀，迅速轉移至裝有1 mL提取介質的2 mL離心管中，冰盒內靜置10 min。使用低溫高速離心機7000 r/min，4℃條件下離心10 min。②棄去上清液。向沉淀中再次加入1 mL提取介質，震蕩至沉淀散開，放入冰盒，靜置 10 min。7000 r/min，4℃條件下離心 10 min。③棄去上清液，向沉淀中加入40 μL β-巰基乙醇，800 μL CTAB搖勻至沉淀散開，放入65℃水浴鍋中水浴加熱60 min，15 min左右顛倒混勻一次。④處理完畢后將離心管從水浴鍋中取出，冷卻至室溫，加入 400 μL TRIS 平衡酚，400 μL 氯仿異戊醇 （v：v=24：1），混勻，室溫下放置 10 min。 12000 r/min，4 ℃條件下離心10 min。⑤取上清液800 μL（每次取200 μL）加入新的2 mL離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇（v：v=24：1），輕輕轉搖試管使溶液充分混勻，10 min。12000 r/min，4 ℃條件下離心 10 min。⑥觀察離心管中液體，若中間蛋白層較多可重復步驟⑤。若蛋白質去除已較完全，用剪去尖端的1 mL槍頭取上清液 400 μL（每次取 100 μL）轉移到 1.5 mL離心管中，先加入 1/10 體積（40 μL）的 NaAc，再加入 2 倍體積（800 μL）的無水乙醇（-20 ℃），-20 ℃放置20 min。取出離心管，12000 r/min，4℃條件下離心3 min。⑦棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2～3次，室溫下干燥，使乙醇揮發。每管加入50 μL 1×TE溶解沉淀，-20℃保存。

1.1.5 DNA樣品的檢測

使用瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度法檢測所得DNA樣品。檢測前在樣品中加入RNA酶1μL，37℃水浴1 h，除去RNA。

1.1.5.1 瓊脂糖凝膠電泳

圖1 部分DNA樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

取 5 μL DNA 樣品， 加入 2 μL 6 × Loading Buffer混勻，在0.8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電壓120 V，30 min。電泳結束后EB染色5min，使用凝膠成像系統觀察采集圖像。

1.1.5.2 紫外分光光度法

光吸收比是檢驗DNA純度的重要指標，純凈的DNA的A260/A280為1.80左右。使用紫外分光光度計檢測DNA樣品在260 mm、280 mm波長處的吸收值。

1.2 CDDP引物的篩選

實驗使用的CDDP引物由上海生工生物有限公司公司合成，編號見表3。

1.2.1 CDDP-PCR體系

選取大管島、長門巖島兩個地區的4份樣品，通過數次反應體系試驗確定最佳PCR反應體系為2×Es Taq MasterMix（含染料）酶 10 μL、10 pmol·μL-1引物 1.0 μL、30 ng·μL-1DNA 模板 2.0 μL 及 ddH2O7μL。

表3 21條CDDP引物信息Table 3 The imformation of 21 CDDP primers

反應過程為94℃預變性3 min；94℃變性 1 min，50℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，35個循環；72℃后延伸5 min。

1.2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測

取6 μL擴增產物，以5 V/cm的電壓在2%瓊脂糖凝膠上電泳1～2 h，EB染色5 min，使用凝膠分析系統觀察采集圖像。

2 結果分析

2.1 基因組DNA的提取

對提取的DNA樣品的檢測結果表明，改良CTAB法得到的DNA電泳帶形好，主帶清晰，無彌散現象（圖1）。DNA樣品的A260/A280在1.71～1.84之間，純度高。

2.2 CDDP引物的篩選

據21條CDDP引物的擴增結果 （表4），引物Pr2、Pr11、Pr12、Pr18 未擴增出任何條帶， 引物 Pr21擴增條帶少，多態性不高；引物 Pr8、Pr13、Pr15、Pr17、Pr19雖得到數量較多的條帶，但其多態性比率不高。其余引物均得到清晰且多態性豐富的條帶。引物Pr3、Pr5、Pr9的多態性比率最高達100%。綜合引物的鑒別力及擴增效果，從21條引物種篩選 出 11 條 （Pr1、Pr3、Pr4、Pr5、Pr6、Pr7、Pr9、Pr10、Pr14、Pr16、Pr20）多態性好，條帶清晰的引物用于后續的CDDP分子標記。其中，多態性比率最的為Pr3、Pr5、Pr9， 態性比率達100%， 最低的 Pr4，為71.43%。

3 討論

高質量的基因組DNA是開展植物分子生物學研究之基礎，由于植物細胞化學成分的差異，對其基因組DNA的提取需要采取不同策略[13]。本實驗根據山茶葉片次生代謝產物多，難以獲得高質量的基因組DNA的特點，在在傳統的CTAB及多種改良CTAB法的基礎上進行改進[14]，如加入PVP、β-巰基乙醇等還原性物質消除酚類氧化對DNA的影響；延長加入CTAB后的水浴時間使細胞膜充分裂解，釋放更多的 DNA；增加使用氯仿-異戊醇（v：v=24：1）的抽提次數，充分除去葉片中的蛋白質；用乙醇洗滌沉淀前加入3 mol·μL-1的NaAc溶液，除去多糖。經檢測，采用本法所得耐冬山茶基因組DNA的純度和得率均較高，能夠滿足分子實驗要求。

CDDP作為一種新型分子標記技術，具有操作簡便、穩定性和重復性好、多態性豐富、引物具有通用性等優勢[5]，在物種親緣關系和遺傳多樣性分析中有重要應用價值。本實驗使用21條CDDP引物對隨機選取的大管島、長門巖島的山茶基因組DNA在 20 μL ，包含 2×Es Taq MasterMix（含染料）酶 10 μL、10 pmol·μL-1引物 1.0 μL、30 ng·μL-1DNA 模板2.0 μL及ddH2O 7 μL的反應體系下進行擴增。共得到11條條帶清晰、多態性豐富、鑒別力強的引物，用于后續的CDDP分子標記。在11條引物中，多態性比率最高的為Pr3、Pr5、Pr9，其多態性比率達100%，多態性比率最低的為Pr4，其多態性比率為71.43%。

表4 21條引物對樣品的擴增結果Table 4 Amplification results of 21 primers

實驗表明，CDDP分子標記在耐冬山茶種質資源的遺傳多樣性分析方面具有應用可行性，為CDDP-PCR技術對耐冬山茶種質資源的親緣關系及其遺傳變異的研究奠定了基礎。

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