前列地爾聯合針刺對噪音性耳聾大鼠耳蝸毛細胞血管內皮生長因子、Bcl-2及Bax表達的影響

賈占偉，何強，張玉波，韓海霞

(河北醫科大學第二醫院耳鼻喉科，河北 石家莊 050000)

當今社會，噪聲污染已成為了人類聽力健康的主要殺手之一。噪音會傷害耳朵感聲器官(耳蝸)的感覺發細細胞，進而對人類聽覺系統造成不同程度的破壞。其原理推斷為噪聲可以造成耳蝸微循環障礙[1]。機體的感覺發細細胞一旦受到傷害，則永遠不會復原，長時間的傷害會形成噪音性耳聾。目前治療耳聾的方法主要有中醫治療、西醫治療及儀器治療。近年來，中醫針灸被越來越多的用于耳聾的治療。本研究從耳蝸基底膜毛細胞毛細胞血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、耳蝸相關凋亡因子Bcl-2、Bax mRNA的表達為切入點，通過動物實驗, 采用RT-PCR的方法，研究針刺聯合前列地爾對噪音性大鼠耳蝸組織VEGF、Bcl-2、BaxmRNA表達的影響及其作用機制, 為臨床應用針刺聯合前列地爾治療耳聾疾病患者提供理論依據和實驗資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物和分組 Wistar大鼠(SPF級)32只，體質量(200±15)g，無中耳炎， 由河北省藥品檢驗所提供，批號為SCXK(冀)2004-1-005。按照隨機數字法分為4組：空白對照組、模型組、前列地爾治療組和針刺聯合前列地爾治療組，每組8只。

1.1.2 儀器 隔音室，北京中醫藥大學附屬醫院提供；81150A 脈沖函數任意噪聲發生器(是德科技有限公司)；A-K200功率放大器(蘇州景通儀器有限公司)；倍頻程噪聲光盤(北京中醫藥大學聽力研究室)；TES-1350A型聲級計(蘇州景通儀器有限公司)；聽覺腦干電位儀(Waters，美國)；FDH-39型耳機(蘇州景通儀器有限公司)；光學顯微鏡(蘇州景通儀器有限公司)。

1.1.3 試劑 蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(北京弘博康醫藥科技有限公司)，氫化可的松注射液，(天津金耀氨基酸有限公司，批號0503171)；Real-Time PCR試劑盒(大連TaKaRa 公司)；Anti-Bax:(Abcam 公司，貨號:ab115193)；Anti-Bcl-2(Aabcam 公司，貨號:ab117115)；EDTA(北方百勝國際生物技術有限公司)；免疫組化SABC試劑盒(南京建成生物工程有限公司)；DAB(上海圖赫實業有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 除對照組外，將其余3組大鼠置于小籠內(30 cm×30 cm×100 cm)，每籠2只，放入暴露艙(1.0 m×0.5 m×1.0 m)，利用81150A 脈沖函數任意噪聲發生器發聲。噪音頻率3 000 Hz，聲強116 dB 聲壓級(sound pressure level，SPL)。大鼠暴露范圍內聲揚不均勻度為±2 dB。每天暴露8 h，共暴露7 d。造模前及造模結束后，檢測各組大鼠聽覺腦干誘發電位(auditory brainstem response，ABR)聽力閾值。檢測方法相關參考文獻[2]。

1.2.2 治療方法 造模完成后, 空白組與模型組每天灌胃12 mL/kg生理鹽水。從暴露前1 d至暴露后20 d，前列地爾組給予實驗大鼠灌胃處理(前列地爾，6 mg·kg-1·d-1，每天1次，共28 d；針刺聯合組在前列地爾治療的基礎上，選三焦經腧穴“翳風”(雙)、“外關”(雙)進行針刺處理，每天1次，每次留針25 min，共28 d。

1.2.3 觀察指標 (1)耳蝸毛細胞VEGF染色：取各組大鼠耳蝸，10%甲醛固定，EDTA 脫鈣，用不同濃度的酒精逐級脫水處理24 h，石蠟包埋，切片。采用ABC 法進行染色，觀察記錄；(2)耳蝸組織Bcl-2 mRNA的表達：取各組大鼠耳蝸，-70 ℃冰箱保存。將其充分研磨，用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法，進行耳蝸組織Bcl-2 mRNA表達的檢測；(3)耳蝸組織Bax mRNA的表達：取各組大鼠耳蝸，-70 ℃冰箱保存。將其充分研磨，用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法，進行耳蝸組織Bax mRNA表達的檢測。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠ABR聽力閾值

由表1可見，造模結束后，各組大鼠ABR聽力閾值均顯著高于對照組，差異有統計學意義，P<0.05。且造模3組大鼠ABR聽力閾值比較，差異無統計學意義，P>0.05。

表1 各組大鼠ABR聽力閾值

*P<0.05，與對照組相比。

2.2 各組大鼠耳蝸基底膜毛細胞VEGF表達

模型組大鼠耳蝸基底膜毛細胞中VEGF 表達較空白對照組低，差異有顯著性意義(P<0.05)；與模型組相比，針刺聯合組大鼠耳蝸基底膜毛細胞VEGF表達較強，差異有顯著性意義(P<0.01)，表明針灸聯合前列地爾治療可以升高VEGF在耳聾模型大鼠耳蝸基地毛細胞中的表達水平，見圖1及表2。

表2 各組大鼠耳蝸基底膜毛細胞VEGF表達灰度值

組別耳數VEGF對照組1673.1±11.0模型組1646.5±9.7*前列地爾組16110.4±15.3針刺聯合前列地爾組16123.9±18.6#

*P<0.05，與對照組比較；#P<0.01，與模型組比較。

2.3 各組大鼠耳蝸組織Bcl-2及Bax mRNA表達

與空白組比較，模型組耳蝸組織中Bcl-2 mRNA表達減弱，Bax mRNA表達增強，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，針刺聯合組Bcl-2 mRNA表達增強，Bax mRNA表達減弱，差異具有統計學意義(P<0.01)，見表3。表明針灸聯合前列地爾治療耳聾大鼠可使其Bcl-2 mRNA表達增強，同時抑制Bax mRNA過度表達，保護耳蝸結構。

表3 各組大鼠耳蝸Bcl-2及Bax mRNA表達

*P<0.05，與對照組比較；#P<0.01，與模型組比較。

3 討論

耳聾又名 “重聽”[3]，是一種聽力障礙疾病。噪音性耳聾的主要形成原因是長時間的遭受高音貝刺激。發生噪音性耳聾后，最早出現的癥狀是耳鳴，常為高音調耳鳴，同時患者也會出現漸進性聽力下降，并且伴有頭暈、頭痛等癥狀。噪聲刺激會導致耳蝸血流循環障礙，引起細胞缺氧，最終導致內耳毛細胞或其他聽神經受損。噪音性耳聾一旦形成，很難被治愈，患者的生活質量將受到嚴重的影響。近年來，噪音性耳聾的發病率呈現逐年上升的趨勢。

研究表明，生物機體耳蝸內的血管收縮、血流速變慢，血流量減少等情況都與長時間高強度的噪聲刺激有關系，進而會出現內皮細胞通透性增加，血管內血液黏度增大，形成血栓，堵塞毛細血管，形成噪音性耳聾的情況[4-10]。機體內存在一種可以促進血管內皮細胞生長的物質，即VEGF，具有高度的特異性。它在機體內部對血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成都有一定的促進作用。Bcl-2是機體內部的一種癌基因。CytC自線粒體釋放與它有著密切的關系，通過對線粒體釋放的控制來實現對凋亡過程的抑制作用[10-12]。與此同時，研究發現機體凋亡活動過程被抑制的關鍵因素之一是體內Bax蛋白與Bcl-2蛋白之間的比例，由此可見 Bax蛋白在控制細胞凋亡的過程中，也發揮著舉足輕重的作用，值得對其作用機制進行深入研究[13]。

近年來隨著中醫治療的發展，針灸也越來越多的被用于耳鳴耳聾的治療上。針灸包括針刺及艾灸，兩者聯合應用，可以起到打通耳部周圍穴位，增加血液流動性，改善耳部周圍血液循環的作用，對于耳聾耳鳴的治療有一定的臨床療效。翳風是針刺及艾灸常用的穴位之一，為腎氣朝耳之所入，三焦元氣之所出的穴位，與人體的大腦相連，有鎮靜聰耳開竅的功效，是治療耳聾常用穴。除此之外，外關也是針刺艾灸常用穴位，可以溝通手厥陰心包經，具有通陽維脈的作用[3]。因此取此兩穴作為本次實驗治療噪音性耳聾大鼠的針刺穴位。

實驗發現，模型組大鼠耳蝸基底膜毛細胞VEGF 表達較空白對照組大鼠低，耳蝸Bcl-2 mRNA表達減弱，Bax mRNA表達增強，差異有統計學意義(P<0.05)，表明噪聲暴露可引起耳蝸組織缺氧，同時耳蝸組織的缺氧也可引起VEGF 的表達降低，進而影響耳蝸Bcl-2、Bax mRNA的表達。與模型組相比，針刺聯合組大鼠VEGF 表達升高，Bcl-2 mRNA表達增強，Bax mRNA表達減弱，差異有統計學意義(P<0.05)，表明針刺聯合前列地爾治療能夠有效的調節大鼠耳蝸VEGF、耳蝸Bcl-2、Bax mRNA的表達。

綜上所述，針刺聯合前列地爾治療能夠有效的促進耳蝸血供的恢復，此法對噪音性耳聾的治療效果比單獨使用前列地爾好。但對于其他類型的耳聾，其療效有待進一步實驗研究。

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